научная статья по теме ИЗМЕНЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В ПРОЦЕССЕ Т-КЛЕТОЧНОЙ ВАКЦИНАЦИИ У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ Биология

Текст научной статьи на тему «ИЗМЕНЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В ПРОЦЕССЕ Т-КЛЕТОЧНОЙ ВАКЦИНАЦИИ У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ»

РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2011, том 5(14), № 3-4, с. 351-359

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

ИЗМЕНЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В ПРОЦЕССЕ Т-КЛЕТОЧНОЙ ВАКЦИНАЦИИ У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ

© 2011 г. И.П. Иванова*, Г.В. Селедцова*, С.В. Мамаев***, Л.С. Литвинова**, Ю.А. Лопатникова*, С.В. Сенников*, В.И. Селедцов**

*

НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск, Россия;

**

Балтийский федеральный университет им. И. Канта, г. Калининград, Россия; *** ФМБА ФГУЗ Клиническая больница № 85, г. Москва, Россия

Поступила: 07.07.2011. Принята: 07.10.2011

Пациенты с ревматоидным артритом были пролечены с использованием вакцины, состоящей из аутологичных коллаген-реактивных Т-клеток. Установлено, что после иммунотерапев-тического курса лечения антиген-специфическая пролиферативная активность мононукле-арных клеток периферической крови пациентов значительно снижалась. Вакцинотерапия приводила также к достоверному снижению уровня 1РЫу и повышению уровня 1Ь-4 в плазме крови пациентов. В соответствии с этим, у больных после курса лечения Т-клеточной вакциной отмечалось снижение числа 1РЫу-продуцирующих СЭ4+ и С08+ клеток в 1,6—1,8 раза, а также параллельное увеличение числа 1Ь-4-продуцирующих СЭ4+ лимфоцитов в 1,7 раза. Кроме того, в настоящем исследовании показано, что у больных ревматоидным артритом в сравнении со здоровыми лицами содержание С08 + С045К0 + С062Ь_ эффекторных Т-клеток памяти и количество центральных С04+С045К0 + С062Ь+ и С08 + С045К0 + С062Ь+ Т-клеток памяти было увеличено в 5 — 7 раз. В процессе лечения у вакцинированных пациентов наблюдалось значительное снижение числа СЭ4+ и СЭ8 + центральных Т-клеток памяти, а также уменьшение количества эффекторных СЭ8+ Т-клеток памяти. Нами обнаружено также, что после вакцинации у больных достоверно увеличивалось количество регуляторных С04+С025 + РохР3+ Т-клеток в периферической крови. Однако количество С04+С025-РохР3+ Т-клеток существенно не менялось в процессе всего периода лечения. В результате клинического применения Т-клеточной вакцинации клиническое улучшение было достигнуто у 87% пациентов.

Ключевые слова: Т-клетки, вакцина, ревматоидный артрит

ВВЕДЕНИЕ

Общепринято, что в основе патогенеза ревматоидного артрита (РА) лежит аутоиммунный процесс, опосредуемый Т-хелперами I типа. Специфическое распознавание Т-лимфоцитами антигенных молекул, экс-прессирующихся на синовиальных суставных поверхностях, запускает цепь событий, приводящих к воспалению и разрушению суставов [1, 2].

Аутореактивные Т-клетки, распознающие собственные антигены, являются составной

Адрес: 630099, Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14, НИИ клинической иммунологии СО РАМН. E-mail: irinaiki@rambler.ra

частью иммунной системы здорового организма. Это значит, что посттимические механизмы контролируют эти аутоагрессив-ные Т-клетки и обеспечивают защиту от них. Такая регуляция может включать периферическую клональную делецию, модуляцию антагонистами цитокинов, ингибицию взаимодействия идиотипов Т-клеточных рецепторов (ТКР). Нарушенная регуляторная сеть приводит к нарушению подавления активированных аутоиммунных клеток и развитию аутоиммунного заболевания [2 — 4].

Является очевидным, что иммунотропное лечение РА должно быть направлено на инактивацию аутоиммунных Т- и В-лимфоцитов, усиление активности естественных и индуци-

рованных регуляторных Т-клеток, подавление продукции провоспалительных медиаторов.

Т-клеточная вакцинация (ТКВ) — введение ослабленных аутореактивных Т-клеток — включает многие регуляторные механизмы иммунного ответа:

— ТКВ индуцирует анти-клонотипические Т-клетки. Они регулируют патогенные Т-клетки через распознавание клонотипи-ческих детерминант (идиотипов), т.е. анти-идиотипический ответ. В основном, это цитотоксические CD8 + Т-клетки, рестрикти-рованные по молекулам МНС I класса. Меньшую долю составляют анти-идиотипические CD4+ Т-клетки. Эти клетки не цитотоксичны для аутореактивных клеток, но ингибируют их пролиферацию, распознавая идиотипиче-ские детерминанты в комплексе с молекулами гистосовместимости II класса. Они могут принадлежать к разным типам Т-лимфоцитов: TH2 — продуцентам IL-4; TH3 — продуцентам TGFß [4-7].

— ТКВ также затрагивает функцию естественных CD4 + CD25+ регуляторных Т-клеток (Treg). Имеются данные, предполагающие, что часть этих клеток обладает специфичностью к ТКР и исходно вовлечена в идиотип-антиодиотипическую иммунорегуляцию. Это означает, что Т-клеточная вакцинация может создавать благоприятные условия для экспансии CD4+CD25+ T reg, специфичных к вакцинальным ТКР [8].

— ТКВ воздействует на анти-эрготипическую регуляцию Т-клеточных реакций, которая не связана с распознаванием идиотипических детерминант. Независимо от своей антигенной специфичности, анти-эрготипические Т-клетки реагируют только на активированные, а не покоящиеся ауторе-активные Т-клетки [4, 9].

— ТКВ индуцирует не только Т-, но и В-клеточные реакции, а именно, образование анти-идиотипических антител, которые связываются и ингибируют аутореактивные Т-клеточные клоны. Они относятся к IgG, распознают ТКР-детерминанты вне зависимости от молекул главного комплекса гистосовме-стимости. Механизм действия таких антител может быть связан с экранированием и функциональной блокадой ТКР [10].

Таким образом, имеющиеся экспериментальные и клинические данные дают основание полагать, что ТКВ может стать эффективным методом лечения аутоиммунных

заболеваний, имеющим большой потенциал для своего дальнейшего развития [11, 12].

Целью настоящей работы было исследование иммунологических и клинических аспектов применения Т-клеточной вакцинации у больных РА.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Технология получения Т-клеточной вакцины

Разработанная нами технология получения Т-клеточной вакцины состоит из двух последовательных этапов. Первый этап включает в себя специфическую селекцию клеток, тогда как второй — их наращивание в необходимом количестве [13, 14]. На первом этапе выделенные из периферической крови мо-нонуклеарные клетки (МНК) пациентов культивировали в концентрации 2 х 106 /мл в среде RPMI 1640, содержащей 10% инактивирован-ной аутологичной плазмы, 5 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 5 х 10-5 М меркаптоэтанола (все реагенты компании «Sigma», США) в присутствии синовиальных (1 мкг/мл) и хрящевых (1 мкг/мл) антигенов в течение 5 — 7 дней во влажной атмосфере с 5% СО2. Хрящевые и синовиальные белковые антигены получены из суставных тканей свиньи. Антиген хрящевой ткани выделяли методом, описанным Strom S.C. [15]. Синовиальный белковый антиген получали путем центрифугирования синовиальной жидкости. На втором этапе антиген-специфические клетки наращивали посредством их стимуляции фитогемагглю-тинином (ФГА, 5 мкг/мл, «Sigma») и реком-бинантным IL-2 (100 ед/мл, «Биотех», Санкт-Петербург) в течение 5 дней. По завершению культивирования клетки инактивировали, далее криоконсервировали стандартным путем в плазме с 10% диметилсульфоксида («Sigma») и хранили в жидком азоте до момента использования. Общее количество полученных от одного больного клеток вакцины варьировало в пределах 18 — 27 х 107.

Пролиферативный ответ полученных таким образом вакцинальных клеток на хрящевые и синовиальные антигены превышал контрольные значения 1,8 — 2,0 раза. В процессе культивирования число IFNy-продуцирующих CD4+ и CD8 + Т-клеток увеличивалось от 3 до 10 раз, содержание CD3 + CD45RO+ Т-клеток памяти увеличивалось в 2 раза, а содержание CD3 + CD45RA+ - в 1,3 раза [16].

Оценка пролиферативного ответа МНК

Для оценки антиген-индуцированного пролиферативного ответа МНК культивировали в 96-луночном планшете в концентрации 2 х 105 в полной среде в присутствии хрящевых (1 мкг/мл) и синовиальных (1 мкг/мл) антигенов либо без них в течение 5 дней во влажной атмосфере с 5% СО2. Клеточная пролиферация учитывалась стандарным методом по включению [3Н] тимидина.

Определение цитокинов в плазме крови и культуральных жидкостях

Количественное содержание цитоки-нов — IFNy и IL-4 в образцах плазмы крови и супернатантах 72-часовых культур МНК оценивали иммуноферментным методом с использованием коммерческих тест-систем компании «Вектор-Бест» (п. Кольцово, Новосибирская область).

Оценка содержания IFNy-и IL-4-продуцирующихлимфоцитов

Количество IFNy- и IL-4-продуцирующих лимфоцитов оценивали с помощью метода определения внутриклеточных цитокинов после 4 ч культивирования МНК периферической крови в присутствии форболово-го эфира, иономицина и брефелдина А. По окончании периода культивации клетки обрабатывали моноклональными антителами к поверхностным маркерам (CD4 и CD8) и после фиксации и пермеабилизации инкубировали в присутствии моноклональных антител (МА) к IFNy и IL-4 (все реактивы «Becton Dickinson», США). После отмывки клетки анализировали на проточном цитометре.

Определение содержания Т-клеток памяти

Относительное содержание клеток памяти определяли методом 3-цветной проточной цитофлюориметриии с помощью меченных фикоэритрином (РЕ) МА к CD4 и CD8 («Сорбент», Москва), конъюгированных с флюоресцеинизотиоцианатом (FITC) МА к СD45RO («eBioscience», США), меченных аллофикоцианином (APC) анти-CD62L МА («eBioscience», США). По наличию или отсутствию на клеточной поверхности соответствующих молекул определяли следующие

клеточные популяции: наивные клетки — (CD45RO-CD62L+), центральные клетки памяти — (CD45RO+CD62L+), эффекторные клетки памяти — (CD45RO+CD62L-). В тексте указан процент каждой популяции от общего числа лимфоцитов.

Определение содержания регуляторных Т-клеток

Поверхностные маркеры регуляторных (CD4+CD25+FoxP3 + ) клеток определяли с помощью МА к CD4, меченных АРС; МА к IL-2 рецептору (CD25), конъюгированных с FITC. Экспрессию FoxP3 оценивали с использованием МА, меченных РЕ (все реактивы «Becton Dickinson», США). Процент позитивных от общего числа лимфоцитов клеток определяли на проточном цитометре «FACS Calibur».

Клинические исследования

Клинические и экспериментальные исследования проводили в соответствии с протоколом, утвержденным Ученым советом и Этическим комитетом Института клинической иммунологии СО РАМН.

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»