МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 4, с. 500-508
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 576.8.095.38:851.155
ИЗМЕНЕНИЕ ПОПУЛЯЦИОННОЙ СТРУКТУРЫ РИЗОБИЙ КЛЕВЕРА (RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM BV. TRIFOLII) ПРИ ПЕРЕХОДЕ ИЗ ПОЧВЫ В КЛУБЕНЬКОВУЮ НИШУ
© 2014 г. Е. Е. Андронов, О. П. Онищук, О. Н. Курчак, Н. А. Проворов1
ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН, Санкт-Петербург Поступила в редакцию 24.06.2013 г.
С помощью анализа ампликонных библиотек методом высокопроизводительного секвенирования выявлены изменения популяционной структуры ризобий клевера (Rhizobium leguminosarum bv. tri-folii) при переходе из почвы в клубеньки растения-хозяина (Trifolium hybridum). При анализе разнообразия ризобий по гену nodA получено 3258 и 1449 нуклеотидных последовательностей (аллельных вариантов) для почвенной и клубеньковой популяций соответственно. Они объединены в 29 операционных таксономических единиц (ОТЕ) по критерию 97% сходства, причем 24 ОТЕ представлены в почвенной, 12 ОТЕ — в клубеньковой популяции, 7 ОТЕ были общими. В составе доминирующей ОТЕ13 (объединяет 77.4% последовательностей из почвенной и 91.5% из клубеньковой популяции) выявлено 155 "почвенных" и 200 "клубеньковых" вариантов гена nodA, причем их нуклеотидное разнообразие при переходе "почва^-клубеньки" существенно возрастало. С помощью метода "скользящего окна" выявлены участки гена nodA, в которых при переходе бактерий из почвенной ниши в клубеньки наблюдают резкое возрастание полиморфизма, в том числе связанное с повышением частоты несинонимических замен. В то же время, при анализе индивидуальных штаммов методом ПЦР-ана-лиза показано, что разнообразие ризобий по составу /G^-генотипов при переходе "почва^-клубень-ки" изменилось незначительно. Полученные данные позволяют предположить, что ускорение эволюции ризобий при симбиозе связано с формированием высоко полиморфных вирулентных субпопуляций, подвергаемых движущему отбору в системе "растение—почва".
Ключевые слова: генетическая структура популяций, ризобии клевера (КЫгоЫшш ^иш1по8агиш ъу. М/оШ), ген образования клубеньков nodA, ПЦР-анализ, высокопроизводительное секвенирование, ампликонные библиотеки, полиморфизм последовательностей ДНК, эволюция симбиоза, движущий отбор.
DOI: 10.7868/S0026365614030033
Важнейшим фактором эволюции бактерий является образование симбиозов с растениями или животными. Для симбиотических бактерий характерно повышение пластичности генома (на основе накопления мобильных элементов — транспозонов, инсерционных и повторяющихся последовательностей ДНК, а также геномных островов и ампликонов) и даже возникновение новых типов его организации (многокомпонентный геном у факультативных, редуцированный — у облигатных симбионтов), что говорит о существенном ускорении эволюции бактерий при симбиозе [1].
Удобными объектами для изучения молекулярных и популяционно-генетических механизмов эволюции симбиоза являются клубеньковые бактерии (ризобии) — азотфиксирующие симбионты бобовых растений. Показано, что расте-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: provorov@newmail.ru).
ния-хозяева играют более важную роль в формировании популяционной структуры ризобий, чем почвенно-климатические факторы [2]. В присутствии хозяев размеры ризобиальных популяций возрастают на несколько порядков, достигая 107— 108 клеток на 1 г почвы или 20—25% от общего числа культивируемых бактерий [3]. Высокие численности ризобиальных популяций, достигаемые при симбиозе, обычно сочетаются с их повышенной гетерогенностью [4], показывая ведущую роль хозяина в эволюции микросимбионтов. Наиболее детально она изучена для штаммов Sinorhizobium meliloti, вступающих в симбиоз с культурной люцерной, Medicago sativa [5], а также для штаммов Bradyrhizobium, взаимодействующих с дикорастущим бобовым Amphicarpaea [6]. В то же время, отсутствие растения-хозяина вызывает снижение популяционного разнообразия у S. meliloti [7] и у B. japonicum [8, 9].
Механизмы повышения популяционного разнообразия ризобий при симбиозе включают индукцию бактериальных мутаций in planta, что было показано при изучении морфологии колоний [10], плазмидных профилей [11] и азотфиксирую-щей активности [12]. Для ризобий характерна высокая интенсивность переноса генов в ризосфере и клубеньках [13—15] и связанное с ним формирование панмиктичных популяций [16]. Однако ключевую роль в повышении генетического полиморфизма ризобий при взаимодействии с растениями играют специфичные для симбиоза формы отбора (частотно-зависимый, междемовый, родственный), которые обеспечивают становление у бактерий способности к мутуалистическому взаимодействию с растениями [1].
Сложность изучения микроэволюции ризобий определяется тем, что их популяционную динамику до настоящего времени характеризовали с использованием ограниченных по объему и нерепрезентативных по составу выборок штаммов, выделенных в чистую культуру из почвы или клубеньков с помощью стандартных микробиологических методов. О структуре этих популяций часто судили по генетическим маркерам, не связанным с симбиозом, что ограничивает изучение связи популяционной динамики ризобий с определяющими ее симбиотическими свойствами.
В настоящей статье мы, используя вновь разработанную методику пиросеквенирования ам-пликонной библиотеки ризобий клевера по гену nodA, показали, что при переходе "почва^клу-беньки" повышение разнообразия бактерий затрагивает доминирующий генотипический класс, обладающий высокой активностью образования клубеньков. Выявление движущего отбора по одному из участков гена nodA говорит о возможности использования разработанной системы для изучения связи молекулярных и популяционно-генетических механизмов эволюции симбиоза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Сбор и выделение бактерий. Для анализа попу-ляционной динамики ризобий клевера (Rhizobium leguminosarum bv. trifolii) использовали выборку из 100 клубеньков клевера гибридного (Trifolium hy-bridum), а также почву, на которой он произрастал (собраны в Голицком ботаническом заказнике, Тернопольская обл., Украина). Луговой фитоценоз, в котором собирали биологический материал, характеризовался высоким разнообразием бобовых: он включал и другие виды клевера (T. montana, T. ochroleucon, T. pratense, T. repens, T. rubens), а также представителей родов Anthyllis, Astragalus, Coronilla, Lathyrus, Lotus, Medicago, Melilotus, Ono-brychis, Vicia. Клубеньки клевера гибридного отбирали с глубины 5—15 см, образцы почвы — с
глубины 10—20 см. Для выделения и хранения штаммов использовали стандартные методы [17].
Выделение ДНК. ДНК выделяли из 0.2 г замороженной почвы, а также из объединенной массы клубеньков после их разрушения с помощью стеклянных шариков в течение 1 мин при максимальной мощности на приборе FastPrep 24 ("MP Medicals", США). При этом материал находился в экстрагирующем буфере, содержащем 350 мкл раствора А (натрий-фосфатный буфер — 200 мМ; гуанидина изотиоцианат — 240 мМ; pH = 7.0), 350 мкл раствора Б (трис-HCl - 500 мМ; SDS -1% w/v; pH = 7.0) и 400 мкл смеси фенола с хлороформом (1 : 1). Полученный препарат центрифугировали при ускорении 13000 g в течение 5 мин. Водную фазу отбирали и повторно экстрагировали хлороформом. ДНК осаждали, добавляя равный объем изопропилового спирта. После центрифугирования осадок промывали 70% этанолом и растворяли в воде при 65°С в течение 5-10 мин. ДНК очищали путем электрофореза в 1% агароз-ном геле и выделяли методом сорбции на оксиде кремния [18].
Анализ нуклеотидного разнообразия гена nodA в тотальных популяциях. Для анализа изменчивости тотальных популяций из почвы и клубеньков мы сконструировали две пары универсальных праймеров, фланкирующих ген nodA, используя результаты анализа 20 нуклеотидных последовательностей данного гена (из GenBank), принадлежащих виду R. leguminosarum. Последовательности были выровнены с помощью программы ClustalX, конструирование вырожденных праймеров осуществляли с помощью программы Primer Premier 5. Две пары праймеров (ndARL268_F DGGHYTG-TAYGGAGTGC; ndARL302_F YTDGGMA-TCGCHCACT ndARL591_R AGYTCSSAC-CCRTTT; ndARL518_R RDACGAGBACRTCTT-CRGT) использовали для амплификации с помощью Taq-полимеразы ("Евроген", Россия) фрагмента гена nodA по схеме двухраундовой ПЦР (nested PCR). В первом раунде использовали внешнюю пару праймеров (ndARL268_F и ndARL591_R) с оригинальными ДНК-матрицами (почвенной или клубеньковой), а во втором раунде — внутреннюю пару праймеров (ndARL302_F и ndARL518_R), используя в качестве матрицы амплификат из первого раунда (температура отжига в обоих раундах 50°С). Эта схема ПЦР позволила с высокой эффективностью амплифицировать внутренний участок гена nodA размером 181 п.н. при использовании в качестве исходных матриц образцов почвенной и клубеньковой ДНК.
Для секвенирования ампликонных библиотек с использованием геномного секвенатора GS Junior ("Roche") были сконструированы fusion-праймеры, содержащие помимо последовательностей nodA мультиплексные идентификаторы,
обеспечивающие одновременное секвенирова-ние нескольких библиотек. Его осуществляли в соответствии с протоколом фирмы "Roche" (одностороннее чтение, библиотека Lib-L).
Изучение полиморфизма маркера IGS у индивидуальных штаммов. Для оценки разнообразия индивидуальных штаммов изучали полиморфизм хромосомного локуса IGS — межгенного участка, входящего в кластер генов 16S рРНК (праймеры FGPS1490 и FGPL1329) [19]. ПЦР проводили в ам-плификаторе MyCyclerTM ("Bio-Rad", США) (температура отжига 55°С), с использованием Taq-полимеразы и дезоксинуклеозид-трифосфатов ("Хеликон", Россия). В качестве матрицы использовали лизаты бактериальных культур; каждую колонию ресуспендировали в 20 мкл лизирующего раствора (25 мМ NaOH, 0.25% SDS), прогревали 5 мин при 95°С, доводили дистиллированной водой до 200 мкл и после центрифугирования использовали в количестве 1 мкл (5—10 нг ДНК) на реакцию.
Полученные ПЦР-фрагменты рестрицирова-ли с помощью фермента MspI ("MBI Fermentas", Литва) и анализировали в 3% агарозном геле ("Хеликон", Россия) с добавлением бромистого этидия (0.5 мг/л). Количество фрагментов рестрикции для каждого штамм
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.