ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 4, с. 565-573
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1:502.55
ИЗМЕНЕНИЕ РОСТОВЫХ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ СОРГО ВЕНИЧНОГО В ПРИСУТСТВИИ ФЕНАНТРЕНА
© 2014 г. Е. В. Дубровская, И. О. Поликарпова, А. Ю. Муратова, Н. Н. Позднякова,
М. П. Чернышова, О. В. Турковская
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов Поступила в редакцию 11.10.2013 г.
Исследованы ростовые и физиолого-биохимические параметры растений сорго (Sorghum bicolor (L.) Moench) в присутствии фенантрена (10 и 100 мг/кг грунта). Через 1 и 2 мес. проанализировали активность внутриклеточных тирозиназ, лакказоподобных оксидаз и пероксидаз. Установлено, что активность тирозиназ в тканях и корней, и листьев положительно коррелировала с уровнем загрязнения на всем протяжении эксперимента; оксидазы обнаруживали активность лишь в первый месяц, она также положительно коррелировала с концентрацией фенантрена. Максимальную активность проявляли внутриклеточные пероксидазы, при этом положительная корреляция с уровнем загрязнения наблюдалась в первый период исследований. Кроме того, присутствие загрязнителя негативно влияло на ростовые характеристики (всхожесть, выживаемость и накопление биомассы растений), снижало суммарное содержание фотосинтетических пигментов и изменяло их соотношение. Максимальная степень элиминации фенантрена обнаружена в корневой зоне растений сорго при высоком уровне загрязнения, что свидетельствует о значительном вкладе растений в разложение (связывание) этого ксенобиотика.
Ключевые слова: Sorghum bicolor - полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) - фенантрен -ферменты
DOI: 10.7868/S0015330314040071
ВВЕДЕНИЕ
Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) являются вездесущими загрязнителями окружающей среды, имеющими как антропогенное, так и природное происхождение [1]. К ПАУ относится и фенантрен - трициклический ароматический углеводород, производные которого широко распространены в живой природе. Естественное самоочищение природных объектов от этих поллютантов протекает крайне медленно, в связи с чем, перемещаясь по пищевым цепям, ПАУ вступают в контакт с целым рядом организмов. При этом на протяжении долгого времени считалось, что только микроорганизмы способны осуществлять детоксикацию ксенобиотиков. Позже было показано, что растения также имеют собственные механизмы обезвреживания токсичных загрязнителей, в том числе ПАУ [1-3]. Одна-
Сокращения: ПАУ — полициклические ароматические углеводороды; Хл - хлорофилл.
Адрес для корреспонденции: Дубровская Екатерина Викторовна. 410049 Саратов, пр. Энтузиастов, 13. Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН). Электронная почта: evdubrovskaya@rambler.ru
ко имеющейся в настоящее время научной информации крайне недостаточно, чтобы оценить вклад растений в процессы самоочищения окружающей среды.
В качестве исследуемого растения несомненный интерес представляет сорго, образующее обильную биомассу, характеризующееся высокой засухоустойчивостью и имеющее большое количество сортов. Все это позволило использовать данный объект для биоремедиации почвы, загрязненной тяжелыми металлами [4], цианидами [5], нефтью [6]. Однако при этом оставались неизученными аспекты влияния поллютантов на физиолого-биохимические показатели растения. Ранее мы исследовали воздействие фенантрена на корневую экссудацию сорго [7].
Цель настоящей работы - выявление изменений в ростовых и биохимических характеристиках сорго в присутствии фенантрена.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве модельного растения использовали сорго веничное (Sorghum bicolor (L.) Moench). Се-
мена предварительно калибровали, отмывали и проводили их поверхностную стерилизацию смесью этилового спирта и перекиси водорода (1 : 1), затем 6-кратно отмывали стерильной водой, в последней порции воды семена оставляли на 12 ч на качалке, проклюнувшиеся семена использовали для посева. Растения выращивали в пластиковых сосудах объемом 1 л, заполненных грунтом (смесь мелкой гальки и крупного песка), тщательно отмытым и высушенным при температуре 160°С. В качестве поллютанта использовали фенантрен в концентрации 10 или 100 мг/кг грунта. Фенан-трен вносили растворенным в ацетоне, грунт тщательно перемешивали и оставляли для полного испарения растворителя на 6 суток, после чего производили посев семян; контролем служил чистый грунт. Вегетационные опыты проводили в фи-токомнате с контролируемыми условиями: температура 23-25°С, освещенность 400 мкмоль/(м2 с), продолжительность светового периода 14 ч, тем-нового - 10 ч. Полив осуществляли питательным раствором для растений (среда Яаикига) [8] до 80% от полной влагоемкости, что составляло примерно 10% по весу.
Учитывали всхожесть и время прорастания семян, а также выживаемость растений в присутствии в грунте фенантрена (процент выживших к концу эксперимента растений к числу взошедших).
Через один и два месяца растения извлекали из вегетационных сосудов, не нарушая корневую систему, тщательно отряхивали корни от грунта. Грунт, оставшийся прикрепленным к корням растений (толщиной не более 2 мм), принимали за ризосферный.
Растения анализировали по следующим показателям: продукция биомассы (надземная и подземная части); содержание хлорофиллов (Хл) а и Ь в листьях и их соотношение; содержание фенан-трена в корневой зоне растений; активность внутриклеточных пероксидаз, оксидаз и тирозиназ.
Для определения продукции биомассы корни отделяли от побегов и высушивали в сушильном шкафу при 60°С до постоянного веса. Расчет биомассы проводили на 1 растение.
Для определения содержания Хл а и Ь брали навеску 20-30 мг листьев, растирали их с кварцевым песком и СаС03 в этиловом спирте; полученный го-могенат центрифугировали при 4000 об./мин в течение 10 мин, супернатант отбирали, доводили объем вытяжки до 5 мл, а затем определяли ее поглощение при 665 и 649 нм. Концентрацию Хл а и Ь и их соотношение рассчитывали, согласно [9].
Для анализа активности ферментов растения дважды отмывали по 30 мин в 0.05 мМ растворе СаС12, затем промывали водой. Из корней и ли-
стьев готовили вытяжки, для этого примерно 200 мг влажной биомассы растирали с кварцевым песком и охлажденным фосфатным буфером, рН6.0, гомогенат центрифугировали при 4000 об./мин в течение 10 мин при 4°С, супернатант отбирали и доводили его объем до 5 мл.
Ферментативную активность в ферментных препаратах оценивали спектрофотометрически. Активность монофенолмонооксидаз (тирозиназ) измеряли по отношению к (3,4-дигидроксифе-нил)-Ь-аланину (концентрация 2 мМ) в 50 мМ буфере Tris-HCl при рН 7.5 [10]. Степень окисления субстрата определяли при X = 475 нм. Окси-дазную активность определяли при длине волны X = 522 нм по окислению сирингалдазина (0.2 мМ) в 50 мМ K-Na-фосфатном буфере при рН 6.0 [11]. Активность пероксидаз определяли по отношению к 2,7-диаминофлуорену (концентрация 0.5 мМ) в присутствии 0.1 мМ H2O2 при длине волны X = 600 нм в 50 мМ K-Na-фосфат-ном буфере при рН 6.0 [10]. Активность выражали в мкмоль/(мин мг белка). Содержание белка определяли по Bradford [12].
Изоформы пероксидазы выявляли методом не-денатурирующего гель-электрофореза в 12% полиа-криламидном геле [13] с последующим окрашиванием о-дианизидином в присутствии Н2О2.
Остаточное содержание фенантрена определяли в ризосфере растений и основной части грунта, для этого образец грунта весом 25 г дважды экстрагировали хлороформом (13 и 12 мл) в течение 20 мин на встряхивателе, затем экстракт фильтровали через стеклянный фильтр Шотта и доводили объем до 25 мл. В полученном экстракте определяли содержание фенантрена на газовом хроматографе Shimadzu 2010 с колонкой Equty-1 ("Supelco", США) с использованием пламенно-ионизационного детектора и гелия в качестве газа-носителя.
Все анализы проводили в 3-5-кратной повтор-ности. Статистическую обработку полученных данных выполняли, вычисляя средние значения, для сравнения которых использовали показатель наименьшей существенной разницы при P = 0.05 с применением теста Фишера, регрессионный и корреляционный анализ. Для вычислений использовали программное обеспечение Statistica software version 7 ("StatSoft", Россия) и Microsoft Excell 2003.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние фенантрена на ростовые показатели сорго
Присутствие фенантрена существенно повлияло на всхожесть сорго, снижая ее на 26 и 40% при
100
«
ч о а н Я о м н о
80 -
60 -
40
св
а
св
С
20
0
12
10
s &
о а
4В
- 2
0
0 10 100 Содержание фенантрена, мг/кг грунта
-о
и
в
в 3
о о
ч g им фо ои
О « R о
р
3
о
е и н
а
жа р
е
д
о С
4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
(а)
2
4
0
[Í
i
10 100
4.0
в
<ч
о
ч ч
и
ф
о р
о
е и н е
В
о
тно
От
2.0 1.5 1.0 0.5
(б)
ib
Í
IÍ1
0 10 100
Содержание фенантрена, мг/кг грунта
Рис. 2. Влияние фенантрена на суммарное содержание (а) и соотношение Хл а/Ъ (б) в листьях сорго. 1 — через 1 мес., 2 — через 2 мес.
Рис. 1. Зависимость всхожести и скорости прорастания семян сорго от содержания фенантрена. 1 — всхожесть, 2 — выживаемость, 3 — время прорастания.
ми при содержании фенантрена 10 мг/кг, а при 100 мг/кг — его токсический эффект продолжал увеличиваться.
8
0
концентрации ПАУ 10 и 100 мг/кг соответственно. По данным корреляционного анализа, время прорастания семян положительно коррелировало с уровнем загрязнения (R2 = 0.53), увеличиваясь с 5.2 в чистом грунте до 9.9 и 10.3 суток при возрастании содержания поллютанта (рис. 1).
Токсическое воздействие фенантрена проявлялось и на последующих стадиях развития растений, вызывая их угнетение, особенно выраженное при содержании фенантрена 100 мг/кг: растения были более низкорослыми, листья у недельных проростков были деформированными и скрученными, а уже к 10 суткам их кончики подсыхали. В дальнейшем они имели слабый тур-гор и бледную окраску. Выживаемость растений сорго достоверно снижалась (R2 = -0.89), оставаясь к концу эксперимента на уровне 30% (рис. 1).
Фенантрен в концентрации 10 и 100 мг/кг достоверно оказывал выраженн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.