ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2011, № 1, с. 101-106
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ =
УДК 577.175.53;618.3-06
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ В НАДПОЧЕЧНИКАХ И В ПЛАЗМЕ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ САМОК И ИХ ПОТОМСТВА ПОД ВЛИЯНИЕМ АНТЕНАТАЛЬНЫХ СТРЕССОВ РАЗНОЙ ЭТИОЛОГИИ
© 2011 г. Л. К. Трофимова*, А. А. Байжуманов*, |Е. Н. Гончаренко*, Я. В. Крушинская**, Н. А. Соколова**, Н. Ю. Кудряшова**
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический ф-т, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12 E-mail: lidia.trofimova@gmail.com Поступила в редакцию 19.03.2010 г.
Исследовали изменения содержания глюкокортикоидов в плазме крови и в надпочечниках у беременных крыс в период раннего органогенеза через сутки после стрессогенных воздействий различной этиологии (острая гипобарическая гипоксия, прерывистая нормобарическая гипоксия и иммобилизация) и у их взрослого потомства. Гипоксические стрессы вызывали значимое снижение уровня глюкокортикоидов у беременных самок через сутки после стресса. У потомства после антенатальных стрессов базальный уровень глюкокортикоидов изменялся разнонаправлено. В основном отклонения наблюдались в женском потомстве.
Е. Н. Гончаренко
Неблагоприятные условия внутриутробного развития (неполноценное питание, болезни, стресс матери) способствуют появлению нарушений развития, последствия которых могут сохраняться в течение всей жизни. К числу таких последствий относят диабет, болезни сердечнососудистой системы, нарушения когнитивных функций и поведения и др. (Barker, 2002; Lau, 2004; Заваденко, 1998).
Установлено, что ряд отклонений в постна-тальном развитии после антенатальных стрессов связан с нарушением функционирования гипота-ламо-гипофизарно-надпочечниковой системы организма (ГГНС), в первую очередь отвечающей за развитие реакций на стрессорное воздействие. С изменениями в ее работе связывают отклонения в поведении, работе сердечнососудистой системы (Welberg, 2001; De Blasio, 2007; Mueller, 2007). Одной из причин сдвигов в работе ГГНС называют программирующее воздействие на зародыш глюкокортикоидов матери, которые в больших количествах продуцируются во время стрессорного ответа материнского организма (Van den Bergh, 2005; Meanay, 2007).
В основном вышесказанное относится к антенатальным стрессам, действовавшим на поздних стадиях беременности, когда развита плацента и ткани плода уже достаточно сформированы для того, чтобы воспринимать гормональные сигналы материнского организма.
Крайне мало исследованы постнатальные последствия для активности ГГНС различных
стрессогенных воздействий, перенесенных в период раннего органогенеза.
Этот срок примечателен некоторыми важными событиями в развитии зародыша (в частности, закладкой нервной и сердечнососудистой системы) (Дыбан, 1975), а также принадлежностью к так называемым критическим периодам развития, во время которых зародыш становится особенно уязвимым к различным неблагоприятным внешним воздействиям (Пучков, 1993). Ранее нами были выявлены отставленные последствия различных антенатальных стрессов этого периода для физического развития, поведения, функционирования сердечнососудистой системы крыс (Граф, 2006; Граф, 2007; Трофимова, 2008).
Целью исследования — выяснить, может ли повлиять антенатальное стрессирование различной этиологии в этот период беременности на ба-зальный уровень глюкокортикоидов в организме матери и потомства.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работу проводили на белых беспородных самках крыс весом 250—300 г (1-я серия экспериментов) и их мужском и женском потомстве (2-я серия экспериментов).
В 1-й серии самок крыс (п = 30) ссаживали с самцами в соотношении 2 : 1. Начало беременности определяли по обнаружению сперматозоидов в вагинальном мазке. На 9-10-е сут беременности (период раннего органогенеза) самок делили
на контрольные и опытные группы. Самок опытных групп подвергали одному из 3 видов стрес-сорных воздействий, к каждой опытной группе имелся собственный контроль. В качестве стрессоров были выбраны 2 гипоксических воздействия (острая гипобарическая гипоксия (ОГГ) и прерывистая нормобарическая гипоксия (ПНГ)) и "мягкая" иммобилизация (ИМ). ОГГ сопровождается развитием терминальных состояний, что позволяет выявить потенциальные защитные возможности организма в условиях срыва адаптации (Граф, 2005). ПНГ сопровождает развитие таких патологических ситуаций, как апноэ во время сна, некоторые болезни дыхательной системы (астма, легочный фиброз) и др. (Neubauer, 2001). ИМ не включает гипоксию в качестве активного действующего компонента и рассматривается как модель преимущественно эмоционального стресса (Pare, 1986).
Для осуществления ОГГ крыс помещали в барокамеру и за 1 мин снижали в ней давление до уровня, эквивалентного 4—5% содержания О2. Действие ОГГ длилось до остановки дыхания или появления первого агонального вдоха животного, но не более 10 мин. В зависимости от времени действия гипоксии животных относили к низкоустойчивым (менее 5-ти мин действия ОГГ), сред-неустойчивым (от 5 до 10 мин действия гипоксии) или высокоустойчивым (выдерживали 10 мин гипоксии). Крысы контрольной группы не подвергались ОГГ (Граф, 2005).
ПНГ вызывали путем помещения крыс в герметичную камеру, куда последовательно по 5 мин подавали воздух или смесь газов, содержащую 10.5% О2, в течение 2 ч (всего 13 эпизодов гипоксии). Контрольные животные в то же время находились в обычной клетке (Neubauer, 2001).
С целью обеспечения "мягкой" ИМ крыс на 6 ч помещали в специальные пластиковые пеналы, ограничивающие движение. При этом животные находились в естественном положении и не подвергались жесткой фиксации. Крысы контрольной группы в то же время находились в просторной клетке (Pare, 1986).
Все стрессорные воздействия осуществлялись в первой половине суток (с 8:00 до 14:00). Во время моделирования ПНГ и ИМ животные соответствующих контрольных и опытных групп находились в условиях пищевой и питьевой депривации.
Для определения уровня глюкокортикоидов (11-оксикортикостероидов) через сутки после стрессорного воздействия животных контрольных и опытных групп декапитировали, затем извлекали и замораживали правый надпочечник, предварительно определив на аналитических весах его влажный вес (мкг). Кровь собирали в пробирку, где обрабатывали раствором гепарина (10 ед./мл). После центрифугирования (15 мин
при охлаждении, 2000 об./мин) отбирали 1 мл су-пернатанта (плазмы) и экстрагировали 3 мл гек-сана, после чего верхний гексановый слой удаляли. К остатку прибавляли 10 мл хлороформа. Также в 10 мл хлороформа растирали каждый из надпочечников. После 20 мин инкубации к образцам добавляли 1 мл 0.1 N NaOH, встряхивали в течение 1 мин, удаляли верхнюю фазу. Далее добавляли 2.5 мл серно-спиртового реактива (H2SO4 и C2H5OH в соотношении 3 : 1), встряхивали, после чего удаляли хлороформную фазу. После 1 часа инкубации флуоресценцию проб измеряли на спектрофлуориметре "Hitachi 850" (Япония) при X = 530 нм (X возбуждающего света — 470 нм) (Панков, 1965). Количество глюкокортикоидов в пробе вычисляли с помощью калибровочной кривой, рассчитанной с использованием стандартных растворов кортикостерона (ICN Biochemical, США) (Меньшиков, 1987). Кортикосте-рон является основным глюкокортикоидом грызунов, что позволяет использовать его для получения калибровочной кривой (Chung, 2005).
Расчет содержания глюкокортикоидов проводили по формуле:
F C
Cexp = —-, где Cexp и Cst — содержание глю-F m
exp
кокортикоидов в опытной (мкг/г ткани для надпочечников или в мкг/мл для плазмы) и стандартной (мкг) пробах соответственно, Fexp и Fst — флуоресценция опытной и стандартной пробы соответственно, m — вес надпочечника (г) или объем плазмы (мл).
Во 2-й серии экспериментов вышеописанные показатели определяли у 8-недельного (постпубертатный период развития) потомства крыс опытных и контрольных групп, отдельно для самцов (n = 87) и самок (n = 90).
Во всех случаях взятие образцов крови и тканей проводили в одно и то же время суток (с 10:00 до 12:00). Уровень глюкокортикоидов, зарегистрированный в эксперименте, выражали в Д% по отношению к уровню, зарегистрированному в соответствующей контрольной группе. Статистическую обработку результатов осуществляли при помощи пакетов программ Statistica 6.0 и Microsoft Office Excel, для определения значимости различий между группами использовали непараметрический U-критерий Вилкоксона—Манна— Уитни. Статистически значимыми считали отличия при уровне достоверностир < 0.05.
Эксперименты проводились в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и Хельсинской декларацией о гуманном отношении к животным.
д%
60
40 20 0 20 40 60
от контрольных значении
V
*
Надпочечники
С 1 (п = 4)
■ 2 (п = 9)
■ 3 (п = 3)
С 4 (п = 6)
т С 5 (п = 8)
*
Плазма крови
Рис. 1. Содержание глюкокортикоидов в надпочечниках и плазме крови беременных крыс через сутки после соответствующего стресса (А% ± ст. ошибка среднего). Крысы, пережившие: острую гипобарическую гипоксию низкой (1), средней (2) и высокой (3) устойчивости; прерывистую нормобарическую гипоксию (4); иммобилизацию (5). п — число животных; * — значимые отличия от соответствующей контрольной группы при уровне достоверности р < 0.05 (для рис. 1, 2).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В 1-й серии экспериментов у беременных самок через сутки после воздействия отмечалось значимое (р < 0.05) снижение содержания глюкокортикоидов в надпочечниках (на 46.6%) и в плазме крови (на 15.1%) после ПНГ и только в плазме крови после ОГГ у самок с низкой устойчивостью к гипоксии (на 43.7%). Иммобилизация не вызвала изменений базового уровня содержания глюкокортикоидов (рис. 1).
Во 2-й серии экспериментов в мужском потомстве содержание глюкокортикоидов статистически значимо уменьшалось (на 22.9%) только в группе крыс, перенесших антенатальную ПНГ, и только в плазме крови (рис. 2а). В то же время в женском потомстве значимые отличия данного показателя от контроля были зарегистрированы у крыс, перенесших антенатальные стрессы разной этиологии. Особенно интерес
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.