ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2013, № 6, с. 760-764
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ =
УДК 579.22
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ, АКТИВНОСТИ ФЕНИЛАЛАНИН-АММИАКЛИАЗЫ И КАТАЛАЗЫ В КОРНЯХ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ
ЛЕКТИНОВ АЗОСПИРИЛЛ © 2013 г. С. А. Аленькина, К. А. Трутнева, В. Е. Никитина
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, 410049 Саратов, просп. Энтузиастов, 13 E-mail: alenkina@ibppm.sgu.ru Поступила в редакцию 21.02.2011 г.
Изучено изменение эндогенного содержания и соотношение свободной и связанной форм салициловой кислоты, а также активности фенилаланин-аммиаклиазы и каталазы в корнях проростков пшеницы при воздействии лектинов двух штаммов азотфиксирующих ассоциативных бактерий рода Azospirillum — A. brasilense Sp7 и его мутанта по лектиновой активности A. brasilense Sp7.2.3. Установлены различия в ответной реакции растений на воздействие лектинов этих двух штаммов. Предложена модель индуцирования устойчивости с помощью лектинов, согласно которой в результате воздействия лектинов на корни проростков происходит накопление свободной формы салициловой кислоты, которая ингибирует активность каталазы, в результате чего происходит накопление перекиси водорода и формируется устойчивость.
DOI: 10.7868/S0002332913060027
Необходимое условие развития экологического земледелия — создание методов и технологий формирования, поддержания эффективного функционирования высокоинтегрированных микробно-растительных систем, сочетающих в себе полезные свойства и растений, и микроорганизмов. В настоящее время информации о функционировании ассоциативных симбиозов пока еще недостаточно для глубокого понимания этого явления, и многие вопросы остаются пока неясными. Кроме общепризнанных ведущих факторов (синтеза фитогор-монов и вклада в азотное питание растений за счет фиксации молекулярного азота), несомненно, существует и ряд других аспектов позитивного воздействия микропартнера ассоциативного симбиоза на жизнедеятельность макропартнера.
С учетом функциональных особенностей ге-магглютинирующих белков азоспирилл, было выдвинуто предположение, что лектины наряду с другими поверхностными структурами способны не только участвовать в адгезии бактерий на корнях растений (Никитина и др., 1996), но и влиять на метаболизм растительной клетки. Действительно, оказалось, что лектины способны стимулировать прорастание семян (Никитина и др., 2004), проявлять по отношению к растительной клетке митогенную и ферментмодифицирующую активности (Чернышева и др., 2005; А1еп'кта а1., 2006), изменять содержание сигнальных соединений (цАМФ, оксида азота (N0), перекиси
водорода в корнях проростков пшеницы) и таким образом участвовать в формировании защитных реакций растений (Аленькина и др., 2010; Аленькина, Никитина, 2011).
В последние годы появилось много работ, показывающих, что при симбиотическом взаимодействии происходит репрессирование или индукция защитных реакций, сопровождающихся изменением содержания активных форм кислорода, усилением активности окислительных ферментов (пероксидазы, каталазы, супероксиддис-мутазы), накоплением фенольных соединений, а также повышением уровня антиоксидантной защиты (Глянько и др., 2007).
Возможность участия салициловой кислоты (СК) в бобово-ризобиальном симбиозе обсуждалась в ряде работ (81аееу а1, 2006; Глянько, Васильева, 2010). Было показано, что при формировании бобово-ризобиального симбиоза интенсивность синтеза СК растения—хозяина снижается, что ведет к блокированию опосредованного ею сигнального механизма, связанного с защитными реакциями макросимбионта. При нормальных условиях синтез СК у макросимбионта регулируется, вероятно, на генном уровне с участием NоА-фактора ризобий. Так, мутация у ризобиального штамма по ^оА-фактору или инокуляция люцерны несовместимым ризобиальным штаммом вели к резкому накоплению СК в корнях, способствуя функционированию СК как сигнальной молеку-
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ
761
лы, инициирующей включение защитных реакций у макросимбионта, что тормозило процессы инфекции и нодуляции.
Цель исследования — изучение влияния лекти-нов азоспирилл на содержание СК, активность фенилаланин-аммиаклиазы (ФАЛ) и каталазы в корнях проростков пшеницы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили два штамма азотфиксирующих ассоциативных бактерий рода Azospirillum (A. brasilense Sp7, полученный из Института микробиологии РАН (Москва) и A. brasilense Sp7.2.3 — мутант по лектиновой активности (Аленькина и др., 1998)), а также корни проростков пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Саратовская 29.
Культуры азоспирилл выращивали на жидкой синтетической среде для флокуляции при 37°С в течение 18 ч (Sadasivan, Neyra, 1985).
Лектины с поверхности клеток выделяли методом Эщдата и Шарона (Echdat et al, 1978). Очищенные препараты лектинов получали ранее описанным способом (Аленькина и др., 2010). Концентрацию белка определяли методом Брэдфорд (Bradford, 1976).
В работе использовали трехсуточные проростки пшеницы. Семена стерилизовали 1 мин 60%-ным этанолом и проращивали на дистиллированной воде при 22°С. Для изучения влияния лектинов на содержание СК корни проростков инкубировали с растворами лектинов в течение 2 ч. Контролем служили корни, не обработанные растворами лектинов.
Для определения количества свободной и связанной форм СК 1 г корней был тщательно отмыт дистиллированной водой и фиксирован горячим 96%-ным этанолом. Корни гомогенизировали, затем СК экстрагировали из корней 80%-ным кипящим этанолом. Экстракт был разделен на две части для получения свободной и связанной форм СК (Palva et al., 1994). Содержание СК определяли на газовом хроматографе Shimatzu GH-2010 (Япония) с использованием колонки Eguity-1 (Supelco) при температуре 200°С.
ФАЛ (КФ 4.3.1.5) экстрагировали из тканей проростков 0.1 М боратным буфером, рН 8.8, при 4° С в течение 30 мин при соотношении масса : : объем 1 : 17. Реакционная смесь состояла из 0.1 мл ферментного препарата и 0.4 мл боратного буфера, рН 8.8, содержавшего 12 мМ L-фенил-аланина. В контроль вместо фермента добавляли 0.1 мл боратного буфера. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Активность фермента определяли спектрофотометрическим методом по изменению оптической плотности при 290 нМ. Активность ФАЛ выражали в единицах
оптической плотности (ДЕ/г сырой массы) (Zucker, 1969).
Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли перманганатометрическим методом (Воскресенская, 2006). Навеску корней проростков (0.2 мг) гомогенизировали в дистиллированной воде, фильтровали и инкубировали 10 мин с 0.3%-ным раствором перекиси водорода. Инкубацию прекращали, добавляя 10%-ную серную кислоту. Не-разложившуюся перекись водорода оттитровыва-ли 0.05 N раствором КМпО4 до появления слаборозовой окраски, не исчезающей в течение 1 мин. Контролем служили корни, которые не инкубировали с растворами лектинов. Активность каталазы выражали в мл О2/(г • мин).
Опыты проводили в трехкратной биологической и пятикратной аналитической повторно-стях. Цифровой материал был обработан статистически с помощью программы "Анализ данных электронных таблиц Microsoft Excel". Данные представлены как средние арифметические из всех определений и их стандартные отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как отмечено выше, в работе исследованы лекти-ны двух штаммов азоспирилл—A brasilense Sp7 и му-тантного штамма A brasilense Sp7.2.3. Лектины этих двух штаммов являются гликопротеинами, выделенными с поверхности бактериальных клеток с молекулярной массой 36 кДд и специфичностью к L-фу-козе и D-галактозе (Аленькина и др., 1998). Лектин мутантного штамма отличался от лектина родительского штамма антигенными свойствами. Ранее было показано, что эти белки обладают различной функциональной активностью (Никитина и др., 2004; Чернышева и др., 2005; Alen'kina et al, 2006; Аленькина и др., 2010; Аленькина, Никитина, 2011).
Изменение содержания СК в корнях проростков пшеницы при воздействии лектинов родительского и мутантного штаммов свидетельствует о том, что они оказывают заметное влияние на этот показатель. Для исследований были взяты четыре концентрации лектинов (5, 10, 20, 40 мкг/мл). В ходе проведенных экспериментов мы измеряли количество свободной и конъюгированной форм СК, поскольку формы СК легко переходят одна в другую и при этом обладают разными биохимической и физиологической активностями (Тарчев-ский и др., 1999). Результаты показали, что лекти-ны изменяли содержание СК лишь через 1 ч инкубации с корнями. Оба лектина вызывали увеличение концентрации свободной формы и уменьшение концентрации конъюгированной формы СК при всех изучаемых концентрациях. Для лектина родительского штамма наблюдалось снижение эффекта с увеличением концентрации лектина. Максимум увеличения свободной СК
Рис. 1. Содержание конъюгированной (I) и свободной (II) форм СК в корнях проростков пшеницы в контроле и при предобработке лектинами A. brasilense Sp7 (а) и A. brasilense Sp7.2.3 (б). 1 — контроль, 2—5 — лектин, концентрации которого составляли 5, 10, 20, 40 мкг/мл соответственно.
отмечался при концентрации 5 мкг/мл. Для лек-тина мутантного штамма максимальное значение наблюдалось при 10 мкг/мл. Для обоих лектинов
Концентрация лектинов, мкг/мл
Рис. 2. Активности ФАЛ (а) и каталазы (б) в корнях проростков пшеницы после инкубирования с лектинами A. brasilense Sp7 (1) и A. brasilense Sp7.2.3 (2). Активности ферментов даны в относительных единицах. За 100% принимались активности ферментов в контроле (корни): ФАЛ — 0.8 ± 0.2 ед./г сырой массы, каталазы — 4 ± 0.2 мл О2/(г • мин).
с увеличением их концентрации происходило снижение оказываемого ими эффекта на содержание связанной формы СК. Максимальное снижение происходило при концентрации лектинов 5 мкг/мл. Лектин мутантного штамма по сравнению с лектином родительского штамма наиболее эффективно увеличивал количество свободной формы СК и менее эффективно изменял содержание связанной формы СК.
Как видно на рис. 1 количество образовавшейся свободной СК и количество гидролизованной связанной СК неравнозначны
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.