КОЛЛОИДНЫЙ ЖУРНАЛ, 2007, том 69, № 5, с. 644-648
УДК 662.73.012 +612.11
ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА И КОАГУЛИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ ПОСЛЕ МЕХАНОХИМИЧЕСКОЙ АКТИВАЦИИ ТОРФА
© 2007 г. А. А. Иванов*, Н. В. Юдина*, Р. Т. Тухватулин**
*Институт химии нефти СО РАН 634021 г. Томск, проспект Академический, 3 **Научно-исследовательский институт биологии и биофизики, Томский государственный университет
634050 г. Томск, проспект Ленина, 36 Поступила в редакцию 11.01.2007 г.
Исследована коагулирующая способность гуминовых кислот (ГК) верхового торфа после его меха-ноактивации. Изучено влияние концентрации ГК и способа их выделения из торфа на обратимую агрегацию эритроцитов крови. Обнаружены зависимости прочности агрегатов эритроцитов и периода их агрегации от концентрации и состава ГК.
ВВЕДЕНИЕ
Гуминовые кислоты (ГК), представляющие совокупность природных высокомолекулярных соединений нерегулярного строения, играют важную роль в жизнедеятельности экосистем. Разнообразие их конформаций и биогеохимических функций определяется гетерогенностью макромолекул, а также внутри- и межмолекулярными взаимодействиями [1-4]. Надмолекулярные образования ГК по своей физико-химической природе неоднородны. Они представлены ассоциатами разной степени компактности. ГК, экстрагированные разными методами из верхового торфа, различаются количеством и соотношением функциональных групп (СООН-, ОН ), углеводных фрагментов и ароматических радикалов [5], что обусловливает и различие в компактности формирующихся надмолекулярных структур.
Для оценки коагулирующей способности ГК в работе [6] было предложено использовать свертывание крови. Реологические свойства крови, как известно [7], существенно зависят от обратимой агрегации эритроцитов. Показатели агрегации могут выступать в качестве универсальных параметров при диагностике коагулирующей и стабилизирующей способности природных препаратов [8]. Среди многих факторов, обеспечивающих способность крови к свертыванию, большую роль играют коагулянты типа витамина К и производных нафтохинона. Поэтому представляет интерес изучение влияния ГК, макромолекулы которых включают упорядоченные конденсированные ароматические ядра и неупорядоченную периферическую часть с большим количеством функциональных групп, на коагуляцию эритроцитов. Цель настоящей работы - исследование
обратимой агрегации эритроцитов иод действием ГК, выделяемых иосле механохимической обработки торфа.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе исиользовали верховой сфагновый торф месторождения "Темное" Томской области (Россия) с низкой стеиенью разложения (5%). Ме-ханохимическую активацию торфа (МА) ирово-дили в ироточной виброцентробежной мельнице ВЦМ-10 (разработанной в Институте химии твердого тела и механохимии СО РАН, г. Новосибирск) с ирименением стальных шаров диаметром 10 мм (ускорение составляло 180 м/с2). Торф обрабатывали как без исиользования химических реагентов, так и с добавками щелочи NaOH (3%) или целлюлозолитического фермента (0.5%) -целловиридина (ЦВ). Обрабатываемые вещества находились в рабочей зоне в течение 2 мин.
ГК выделяли из растворов, образующихся в результате экстракции из торфа водорастворимых комионентов и лииидов, исиользуя 0.1 н. №ОН с иоследующей нейтрализацией щелочи 10%-ным раствором HCl. Структуру ГК изучали методами ЭПР- и 13С ЯМР-сиектроскоиии. Регистрацию сиектров ЯМР осуществляли на радио-сиектрометре ЯМР фирмы Bruker (Германия) с исиользованием методики Фурье-иреобразова-ния с накоилением. Содержания иарамагнитных центров оиределяли на ириборе EPR Spektrometr SE/X-2544 [8].
Обратимую агрегацию эритроцитов исследовали на ириборе, в котором был реализован вибрационный фотометрический сиособ оиределе-ния оитической илотности в микрообъемах крови
[6, 7, 9]. Свет от источника излучения (после прохождения через кювету с исследуемой пробой крови) попадает на фотодетектор, где оптический сигнал преобразуются в электрический, усиливается и поступает на регистрирующий прибор. Из измерений интенсивности проходящего света и величины механического воздействия на систему определяли минимальную и0 и максимальную иА механическую прочности агрегатов эритроцитов, а также скорость агрегации эритроцитов и количество клеток, принимающих участие в процессе агрегации.
При оценке интенсивности разрушающих усилий принимали во внимание следующие соображения: величина локальных сдвиговых усилий, непосредственно разрушающих агрегаты, пропорциональна амплитуде колебаний стенки кюветы, которая, в свою очередь, пропорциональна величине напряжения питания вибратора, являющегося источником колебаний. На рис. 1 приведена схема, поясняющая принцип, на котором основано определение показателей обратимой агрегации эритроцитов исходя из фотометрической кривой и из зависимости напряжения питания вибратора от времени. В случае, когда имеет место полная агрегация эритроцитов, оптическая плотность исследуемой пробы минимальна и постоянна во времени (участок 0-1). Когда включается напряжение и возникает вибрация, оптическая плотность крови увеличивается не сразу (участок 1-2), а после достижения некоторой величины и0 (точка 2). Проведенные одновременно микроскопические исследования показали, что рост оптической плотности обусловлен разрушением агрегатов. Следовательно, по величине и0 можно судить об их минимальной механической прочности. Дальнейшее увеличение напряжения питания вибратора приводит к еще большему разрушению агрегатов и связанному с ним уменьшению прозрачности исследуемой пробы (участок 2-3). Величина напряжения ил, начиная с которой дальнейшее возрастание разрушающих усилий не приводит к увеличению оптической плотности (точка 3), вероятно, вследствие полного разрушения агрегатов, характеризует их максимальную механическую прочность. Фотометрическая кривая при этом выходит на плато (участок 3-4).
Прекращение разрушающих воздействий (точка 4) вызывает спонтанную агрегацию эритроцитов (участок 4-5). При завершении этого процесса фотометрическая кривая выходит на плато (участок 5-6). Скорость агрегации эритроцитов характеризовали временем, в течение которого амплитуда фотометрического сигнала изменяется на 50% (полупериод агрегации). При этом за 100%-ное изменение амплитуды фотометрического сигнала принимали расстояние А (мм) между плато на фотометрической кривой (рис. 1), которые соответствуют полной дезагрегации (участок 3-4) и полной агрегации эритроцитов (участок 5-6).
Прозрачность крови
Рис. 1. Схема, поясняющая принцип определения показателей обратимой агрегации эритроцитов. I - зависимость оптической прозрачности крови от времени при дезагрегации и спонтанной агрегации эритроцитов, II - зависимость напряжения питания вибратора от времени.
На основании измеренных значений рассчитывали индекс I = Ц/т и интегральный коэффициент агрегации К = и0ЦА/т, характеризующие процессы агрегации и дезагрегации. Данная методика имеет ряд достоинств. Она позволяет регистрировать четыре параметра агрегационного процесса, требует для анализа относительно небольшое количество исследуемого образца (0.005 мл), обладает высокой чувствительностью. Исследование обратимой агрегации эритроцитов проводили в щелочных растворах при содержании ГК 0.001 и 0.0001 вес. %. Все показатели агрегации эритроцитов рассчитывали по отношению к контролю.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Коллоидно-химические свойства и способность ГК к хелатообразованию во многом определяются особенностями химического строения этих высокомолекулярных полимерных молекул [2]. В то же время состав и реакционная способность ГК зависят от способа их выделения из торфа и дополнительной обработки. ГК не растворяются в воде. Для практического использования необходимо перевести гуминовые препараты в растворимое состояние, уменьшить молекулярную массу, повысить реакционную активность. Это достигается различными физическими и химическими методами, например, при механохимиче-ской активации [10-12]. Механоактивация торфа в присутствии различных реагентов позволяет изменить выход и характеристики основных компонентов. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что при механообработке выход ГК повышается на 14.2-33.4% по сравнению с исходным торфом (рис. 2). Наибольшее количество ГК уда-
Содержание, масс.%
Исходный Без 0.5% ЦВ 3% №ОН торф добавок
Условия механоактивности
Рис. 2. Выход ГК после механоактивации торфа.
ется выделить из торфа в присутствии фермента (увеличение на 33.4%). Такой высокий выход возможен за счет деструкции трудногидролизуемых веществ.
Данные 13С ЯМР-спектроскопии (табл. 1) показывают, что после МА состав ГК заметно изменяется: понижается доля алкильных заместителей и повышается количество кислородсодержащих ароматических (СарО) и алифатических (СалкО) фрагментов. При обработке торфа в присутствии фермента ЦВ увеличивается количество углеводных фрагментов в ГК, что может быть связано с разрывом гликозидных связей в макромолекулах. В молекулах ГК, выделенных из торфа при обработке с NaOH, повышается доля ароматических и углеводных составляющих [13, 14]. Увеличение общего количества кислородсодержащих групп после механической обработки торфа позволяет сделать вывод о существенной роли процессов окисления препаратов кислородом воздуха.
Структурные фрагменты ГК можно условно разделить на гидрофильные и гидрофобные. Их соотношение определяет растворимость макромолекул, их пространственную организацию и функциональные свойства [15, 16]. По результа-
там исследования фрагментного состава ГК рассчитывали отношение содержания гидрофильных и гидрофобных фрагментов (табл. 2). В ГК, выделенных из исходного и обработанного NaOH торфов, данное отношение ниже 1. При механоактивации торфа и обработке его ЦВ в макромолекулах повышается доля гидрофильных фрагментов.
Парамагнитные свойства ГК отличаются высокой устойчивостью и обусловлены взаимодействиями ароматических систем полисопряжения и функциональных групп [17]. В ЭПР-спектрах ГК были обнаружены узкие симметричные син-глетные линии при ^-факторе, равном 2, что характерно для неспаренного электрона свободных радика
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.