научная статья по теме ИЗМЕНЕНИЕ СВОЙСТВ ПРИОНА [PSI+] ПРИ КОМБИНИРОВАНИИ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕН В N-ДОМЕНЕ БЕЛКА SUP35 Биология

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 2, с. 314-321

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

УДК 575.2:582.282.23

ИЗМЕНЕНИЕ СВОЙСТВ ПРИОНА [PSI+] ПРИ КОМБИНИРОВАНИИ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕН В N-ДОМЕНЕ БЕЛКА Sup35

© 2014 г. С. А. Бондарев, Е. Д. Широколобова, Н. П. Трубицина, Г. А. Журавлева*

Кафедра генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета,

Санкт-Петербург, 199034 Поступила в редакцию 30.10.2013 г. Принята к печати 22.11.2013 г.

Прион [PSI+] — амилоидная изоформа фактора терминации трансляции Sup35 (eRF3). Несмотря на продолжительную историю исследований прионных амилоидов, структурная организация этих белковых агрегатов остается неизвестной. За образование прионных амилоидов Sup35р отвечает N-концевой домен этого белка, формирующий, согласно современным представлениям, суперскладчатую р-структуру. Ранее мы получили пять двойных мутаций в участке SUP35, кодирующем прионный домен, и изучили свойства мутантных белков. Мутации sup35-M1 (YQ46-47KK) и sup35-M2 (QQ61-62KK) приводили к потере приона [PSI+], в то время как остальные мутантные аллели (sup35-M3, QQ70-71KK; sup35-M4, QQ80-81KK и sup35-M5 QQ89-90KK) поддерживали прион. С целью более детального изучения эффекта каждого аллеля на агрегацию Sup35р мы охарактеризовали поддержание и свойства приона [PSI+] в штаммах дрожжей с сочетанием разных комбинаций мутантных аллелей. Полученные нами данные позволили уточнить предполагаемую организацию р-слоев, образуемых отдельными участками прионного домена Sup35p, в составе амилоида. Нами также получены свидетельства того, что мутации sup35-M2 и sup35-M4 меняют структуру прионных агрегатов. Дестабилизация приона под влиянием этих мутаций, судя по всему, связана со снижением эффективности фрагментации гетероагрегатов шаперонами.

Ключевые слова: прионы, [PSI+], Saccharomyces cerevisiae, SUP35, мутации.

MODIFICATION OF [PSI+] PRION PROPERTIES BY THE COMBINATION OF AMINO ACID CHANGES WITHIN Sup35 PROTEIN N-DOMAIN, by S. A. Bondarev, E. D. Shirokolobova, N. P. Trubi-tzina, G. A. Zhouravleva* (Department of Genetics and Biotechnology, St. Petersburg State University, St. Petersburg, 199034 Russia; *e-mail: zhouravleva@rambler.ru). [PSI+] prion is an amyloid isoform of a release factor Sup35p (eRF3). The structure of these protein aggregates remains unclear despite a long term history of prion amyloids investigations. The N-terminal domain of Sup35p (which is responsible for a propagation of prion) shapes superpleated p-structure, according to modern concepts. Recently we constructed five double mutations within SUP35 sequence encoding the N-terminal prion-forming domain and investigated properties of mutant proteins. Mutations sup35-M1 (YQ46-47KK) and sup35-M2 (QQ61-62KK) lead to [PSI+] prion loss, while other mutant alleles (sup35-M3 QQ70-71KK; sup35-M4 QQ80-81KK; sup35-M5 QQ89-90KK) maintained prion. For the detail analysis of effects of mutant alleles on Sup35p aggregation we characterized propagation and properties of [PSI+] prion in yeast strains bearing different mutant allele combinations. The data obtained have refined a supposed organization of p-sheets forming by different regions of Sup35p prion-forming domain within amyloid. Also we obtained evidences that mutant sup35-M2 and sup35-M4 alleles change structure of prion aggregates. The prion destabilization by these mutations possibly is connected with decrease of heteroaggregate fragmentation by chaperones.

Keywords: ргюпб, [PSI+], Saccharomyces cerevisiae, SUP35, mutations.

DOI: 10.7868/S0026898414020037

Впервые термин прион был предложен для обозначения возбудителей инфекционных губчатых энцефалопатий, развитие которых обусловлено образованием отложений белка PrP (от prion protein) в его прионной конформации. При этом белок, имеющий прионную структуру, индуциру-

* Эл. почта: zhouravleva@rambler.ru

ет изменение трехмерной структуры такого же белка, но в нативной конформации [1]. На сегодняшний день у млекопитающих обнаружен только один белок PrP, способный переходить в прионную форму, но среди представителей низших эукариот описано более 10 таких белков,

причем в большинстве случаев их прионизация не приводит к гибели клеток (см. обзор [2, 3]). Один из наиболее изученных дрожжевых прио-нов — [PSI+] (прионная изоформа белка Sup35, фактора терминации трансляции eRF3). В прион-ной конформации этот белок формирует в клетке амилоидные агрегаты, что влечет за собой снижение эффективности терминации трансляции и нонсенс-супрессию (см. обзоры [4, 5]).

В белке Sup35p выделяют три домена [6]. С-кон-цевой домен необходим для участия в терминации трансляции, он гомологичен фактору элонгации eEF1-A (см. обзор [7]). N-концевой домен обогащен остатками глутамина и аспаргина, а также содержит шесть олигопептидных повторов (OR) [6]. Этот участок не относится к жизненно необходимым, не вовлечен в терминацию трансляции [8], но необходим для индукции [9] и поддержания [PSI+] [10]. Средний домен обогащен заряженными аминокислотными остатками [6]. Он не участвует в терминации трансляции, но потенциально может влиять на поддержание [PSI+], поскольку содержит сайт связывания с дезагрегазой Hsp104p [11].

Ранее мы получили серию аллелей sup35KK [13], локализованных в участке, кодирующем N-конце-вой прион-формирующий домен белка Sup35. Му-тантные белки содержали аминокислотные замены в одном из пяти OR N-домена, где два центральных остатка глутамина были заменены положительно заряженными остатками лизина (в случае мутации в первом OR вместо одного из остатков глутамина был тирозин). Такие мутации должны были приводить к дестабилизации прион-ных агрегатов. Это предположение, а также выбор положений для мутаций были основаны на модели суперскладчатой Р-структуры [12]. Согласно полученным результатам, четыре из пяти аллелей (sup35-M1 (YQ46-47KK); sup35-M2 (QQ61-62KK); sup35-M4 (QQ80-81KK); sup35-M5 (QQ89-90KK)) влияют на стабильность и свойства [PSI+] как в сочетании с аллелем дикого типа, так и в гомозиготном состоянии [13]. Мы также предположили, что мутации, способные поддерживать прион, изменяют Р-структуру агрегатов Sup35p. Исходя из этого, сочетания мутантных аллелей, вероятно, должны по-разному влиять на поддержание приона. В представленной работе изучены эффекты сочетаний аллелей sup35-M1—sup35-M5 на поддержание [PSI+].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Штаммы. В работе использовали штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, полученные на основе штамма 10-7A-D832 (Mat a ade1-14 his7-1 leu2 lys2 trp1 ura3 sup35A::TRP1 [pYCH-U2-SUP35] [PSI+] [PIV+]), содержащего делецию гена SUP35 [13]. Единственная копия этого гена была локали-

зована на центромерной плазмиде. Использованные штаммы отличались аллелями SUP35, поддерживающими прион.

Для амплификации плазмидной ДНК использовали штамм Escherichia coli DH5a (supE44 AlacU169 (ф80 lacZAM15) hsdR17 recAl endAl gyrA96 thi-1 relAl) [14].

Плазмиды. Центромерные плазмиды серии pRSUl [15], содержащие ген SUP35 дикого типа либо мутантные аллели, были сконструированы ранее [13]. Аналогичные плазмиды серии pRSU2 получены с помощью переклонирования фрагмента SUP35, ограниченного сайтами рестрикции HindIII, из pRSU1-sup35KK. В работе использованы следующие аллели sup35KK (номера мутаций соответствуют номерам OR): sup35-M1 (YQ46-47KK); sup35-M2 (QQ61-62KK); sup35-M3 (QQ70-71KK); sup35-M4 (QQ80-81KK); sup35-M5 (QQ89-90KK).

Среды и условия культивирования. В работе использовали стандартные культуральные среды, применяемые при работе с дрожжами: полную среду (YEPD), синтетическую среду (SC) и селективные среды, не содержащие отдельных компонентов среды SC [16]. Для потери плазмид c маркером URA3 использовали среду с 5-FOA (5-фто-роротовая кислота) в концентрации 1 г/л [16]. Бактерии выращивали на полной среде LB. Селекцию устойчивых к ампициллину трансформантов проводили на среде LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл [17]. Штаммы дрожжей выращивали при температуре 30°C, штаммы бактерий — при 37°C. Присутствие приона [PS/+] оценивали по способности клеток дрожжей супрессировать мутацию adel-14 (UGA), что приводило к росту на среде без аденина (—Ade), а также к белому цвету колоний, росших на % YEPD [18]. Колонии клеток [psi-] имели красный цвет и не могли расти на среде без аденина. Для изгнания приона [PS/+] из клеток использовали среду YEPD с гидрохлоридом гуанидина в концентрации 5 мМ.

Генетические, микробиологические и молекулярные методы. Использовали стандартные генетические, микробиологические и молекулярные методы работы с дрожжами-сахаромицетами [16]. Трансформацию дрожжей проводили согласно [16, 19].

Размеры агрегатов Sup35p сравнивали с использованием полуденатурирующего электрофореза в агарозном геле (SDD-AGE) [20, 21]. Термостабильность агрегатов Sup35p анализировали согласно описанному ранее протоколу с незначительными изменениями [22]. Вестерн-блот-гибридизацию проводили по стандартной методике [23]. Для визуализации Sup35p использовали поликлональные антитела SE4290 к полноразмерному белку Sup35 [24]. Все опыты с ис-

Аллель,

поддерживающий прион:

Вносимый аллель: sup35-M1

sup35-M2

sup35-M3

sup35-M4

sup35-M5

sup35-M3

sup35-M4

sup35-M5

1/4 YEPD

-Ade

1/4 YEPD

Ade

1/4 YEPD

Ade

Рис. 1. Аллели sup35-M2 и sup35-M4 приводят к дестабилизации приона [PS/+]. Представлены серии пятикратных разведений типичных трансформантов на средах для детекции супрессии мутации ade1-14: 1/4 YEPD и среде без аденина (—Ade). Над каждой панелью указан аллель SUP35, поддерживающий прион; слева перечислены аллели, внесенные в клетки.

пользованием SDD-AGE проводили не менее чем в двух повторностях. Количественную оценку содержания Sup35p в клетках проводили с помощью программы ImageJ 1.47i (Wayne Rasband National Institutes of Health, США). Полученные данные нормировали, принимая количество агрегированного при 25°C Sup35p за 100%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эффекты комбинаций аллелей sup35KK изучали с использованием штаммов [PSY+], несущих аллели sup35-M3, sup35-M4 и sup35-M5, так как они могли поддерживать пр

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.