МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 406-415
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.8.[012.4+033]
ИЗМЕНЕНИЕ ТОНКОЙ СТРУКТУРЫ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ СОЛЕЙ-ХАОТРОПОВ
© 2004 г. В. И. Дуда*, В. Н. Данилевич**, H. Е. Сузина*, А. П. Шорохова*, В. В. Дмитриев*, О. Н. Мохова***, В. Н. Акимов*
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина, Пущино **Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Москва ***Пущинский государственный университет Поступила в редакцию 01.12.03 г.
Электронно-микроскопическое изучение ультратонких срезов дрожжей - Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris и грамположительных бактерий - Micrococcus luteus и Bacillus subtilis позволило установить, что в клетках, подвергнутых воздействию солей-хаотропов (6 M гуанидинийхлорида и 4 M гуанидинийтиоцианата) в течение 3-5 ч при 37°С или 5-6 мин при 100°С, происходят деградативные процессы, затрагивающие почти все клеточные структуры. Однако клеточная стенка в основном сохраняет свою целостность, ультраструктуру и ригидность, что обуславливает поддержание исходной морфологии клетки. Показано, что высокомолекулярная ДНК локализуется в одном из новообразованных компартментов клетки - эктоплазме (периферической гидрофильной зоне). Воздействие солей-хаотропов на споры Bacillus subtilis приводит к разрушению мембран (внешней и внутренней) и частично - наружного и внутреннего слоев белковых покровов. При этом кортекс (слой муреина) сохраняется интактным. Сердцевина спор становится доступной для красителей и дифференцируется на участки с высокой и низкой электронной плотностью. Выбраны режимы обработки клеток солями-хаотропами, необходимые для изучения эффективности ПЦР in situ с использованием олигонуклеотидных праймеров для генов 18S и 16S рРНК.
Ключевые слова: ультраструктура микроорганизмов, соли-хаотропы, мембраны, оболочки, клеточные стенки, хроматин, ПЦР in situ.
Известно, что соли-хаотропы, в частности, хлорид и тиоцианат гуанидиния, оказывают специфическое воздействие на живые клетки микроорганизмов: они разрушают мембраны, рибосомы и другие клеточные структуры, обуславливая таким образом дезинтеграцию клеток и переход ДНК в свободную форму [1-5]. В связи с этим некоторые соли-хаотропы (СХ) предложено использовать для выделения ДНК и РНК из клеток грамотрицательных бактерий, а также клеток и тканей животного происхождения [1-4]. Важную роль играет свойство СХ вызывать быструю денатурацию всех клеточных белков, в том числе нуклеаз. Недавно были получены новые данные, свидетельствующие о том, что клетки микроорганизмов, обладающие прочными толстыми клеточными стенками (дрожжи, мицелиальные грибы и грамположительные бактерии) не разрушаются до конца и сохраняют свою форму даже после кипячения в растворах СХ [5]. Как установили авторы, обработка хаотропными растворами в широком диапазоне температур (от 20 до 100°С) позволяет экстрагировать из клеток значительную часть белков, липидов и РНК, а также все низкомолекулярные компоненты. При этом в
обработанных СХ клетках удерживается высокомолекулярная геномная ДНК, способная служить матрицей в полимеразной цепной реакции (ПЦР) [5] и доступная для неспецифических (микрококковая нуклеаза) и специфических (рестриктазы) нуклеаз [8]. Однако тонкая структура клеток, обработанных СХ, локализация в них нуклеиновых кислот, состояние клеточной стенки, мембран и других клеточных структур не изучены с помощью высокоразрешающей электронной микроскопии. В связи с этим цель настоящей работы состояла в выяснении особенностей ультраструктурной организации вегетативных и покоящихся клеток эукариотных и прокариотных микроорганизмов, подвергнутых воздействию СХ при различных режимах обработки объектов.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты. В исследованиях использовали следующие культуры микроорганизмов: дрожжи Saccharomyces cerevisiae (штамм Y190 ИБХ РАН), Pichia pastoris (штамм GS115, ИБХ РАН) и грамположительные бактерии Micrococcus luteus (штамм NCIMB 13267) и Bacillus subtilis
(штамм ВКМ B-504). Дрожжи культивировали на агаризованной среде YPD (1.0% дрожжевого экстракта, 2% бактопептона, 2.0% глюкозы; 1.5% агара; рН 5.3) в чашках Петри при 30°С в течение 3 сут. Бактерии выращивали на МПА в чашках Петри при 29°С в течение 3 сут. Споры B. subtilis собирали после инкубирования культур в течение 10 сут.
Обработка клеток солями-хаотропами. С целью пермеабилизации клеток и экстракции из них белков и липидов использовали буферные растворы: D, содержащий 4 М гуанидинийтиоци-анат ("Fluka"), 25 мМ цитрат натрия, рН 7.0, 0.1 М Р-меркаптоэтанол, 0.5% саркозил (лауроилсарко-зил, Na-соль) (ICN Biomedicals) [1]; D-2, содержащий 4 М гуанидинийтиоцианат, 50 мМ mpuc-HCl, pH 8.0, 5 мМ ЭДТА, 0.1 М Р-меркаптоэтанол, 0.5% саркозил, а также E, содержащий 6 М гуани-динийхлорид ("Fluka"), 30 мМ mpuc-HCl, pH 8.0, 5 мМ ЭДТА, 0.1 М Р-меркаптоэтанол, 0.5% саркозил. Процедура обработки детально описана в статье Данилевича и Гришина [5]. В настоящей работе использованы следующие варианты обработки клеток микроорганизмов: а) инкубация в буфере D или D-2 при 37°С в течение 5 ч с трехкратной сменой буфера; б) инкубация в буфере D или E при 100°С (на кипящей водяной бане) в течение 5 мин; в) двойная обработка по процедуре варианта б в течение 6 мин; г) обработка клеток по процедуре варианта а, с последующей инкубацией в фосфатном буфере (рН 7.0), содержащем микрококковую нуклеазу (1 мг/мл) (Millipore Co.), в течение 1 ч при 37°С. Для обработки спор B. subtilis готовили буфер D-3, отличающийся от D-2 более высоким содержанием ЭДТА (50 мМ). Этот буфер смешивали с равным объемом фенола, насыщенного 0.1 М mpuc-HCl, pH 8.0. Сухие споры обезжиривали в хлороформе, подсушивали, а затем суспендировали в воде. Избыток воды удаляли центрифугированием, а полученный влажный осадок спор суспендировали в 10-кратном избытке буфера D-3. Суспензию инкубировали при 100°С в течение 10 мин, затем споры осаждали центрифугированием и дважды промывали дистиллированной водой.
Светомикроскопические наблюдения проводили с помощью микроскопов: МБИ-15, укомплектованного фазово-контрастным устройством, и люминесцентного - ЛМ-2 (ЛОМО). Флуорохро-мирование ДНК в клетках осуществляли акридином оранжевым (0.4 М раствор в цитратно-фосфат-ном буфере, pH 4.5, или DAPI - 1.0 мкг/мл).
Электронно-микроскопические методы исследования. Осадок клеток микроорганизмов после центрифугирования фиксировали в 1.5%-ном растворе глутарового альдегида в 0.05 М какодилат-ном буфере (рН 7.2) при 4°С в течение 1 ч; трижды отмывали в том же буфере и дополнительно фиксировали в 1%-ном растворе OsO4 в 0.05 М
какодилатном буфере (рН 7.2) в течение 3 ч при 20°С. После обезвоживания ацетоном материал заключали в эпоксидную смолу Ероп 812. Ультратонкие срезы монтировали на опорные сеточки и контрастировали в течение 30 мин в 3%-ном растворе уранилацетата в 70%-ном спирте и дополнительно окрашивали цитратом свинца по Рей-нольдсу [6] при 20°С в течение 4-5 мин (вариант I). В варианте II после глутар-осмиевой фиксаци-ии (как в варианте I) обезвоживание клеток проводили в 30%-ном этаноле, содержащем 4% уранилацетата, срезы дополнительно окрашивали только 3%-ным раствором уранилацетата в 70%-ном спирте в течение 30 мин. Ультратонкие срезы просматривали и фотографировали в электронном микроскопе 1ЕМ-100В (ТЕОЬ, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Электронно-микроскопический анализ ультратонких срезов дрожжей Saccharomyces cerevisi-ае и РкЫаpastoris показал, что в клетках, обработанных солями-хаотропами (СХ) при 37°С в течение 5 ч и при 100°С в течение 5 мин, происходят следующие изменения: 1) полностью разрушается мембранный аппарат, состоящий, как известно, у дрожжей из цитоплазматической мембраны, митохондриальной, ядерной, вакуолярной мембран и эндоплазматического ретикулюма (рис. 1, 2, 4-7, контрольный вариант - рис. 3). Лишь в редких случаях в периферическом слое модифицированной цитоплазмы (эктоплазме) сохраняются фрагменты мембран (рис. 8). Они имеют типичный для мембран трехслойный профиль на поперечных срезах и толщину ~75 А; 2) происходит деградация рибосом, и их невозможно идентифицировать в оставшейся цитоплазме; 3) разрушается большинство липидных гранул, присутствующих в исходных интактных клетках в значительных количествах; 4) резко изменяется строение протоплазмы. Она дифференцируется на две крупные зоны: периферическую ("эктоплазма") и центральную ("эндоплазма"). Эндоплазма имеет вид центрального тельца (ЦТ), ее матрикс отличается высокой электронной плотностью и мелкогранулярной структурой. У некоторых клеток в матриксе содержатся мелкие (рис. 1, 6, 7, 9) либо крупные (рис. 2, 5) электронно-прозрачные гранулярные и везикулярные структуры, образовавшиеся, вероятно, в результате выделения газообразных веществ. Хорошая окрашиваемость ЦТ тетраокисью осмия, даже после обработки клеток нуклеазами (рис. 8, 9), позволяет предолжить присутствие в матриксе ЦТ липидов. В экто- и эндоплазме клеток, обработанных в буфере с гуа-нидинийтиоцианатом и подвергнутых воздействию микрококковой нуклеазы, обнаруживаются короткие фрагменты мембранных структур
Рис. 1-10. Электронно-микроскопические снимки ультратонких срезов клеток дрожжей S. cerevisiae (рис. 1-5 и 8-10) и P. pastoris (рис. 6, 7); фиксация и окраска срезов - по варианту I (см. Объекты и методы). На рисунках показаны клетки: обработанные в буфере D в течение 5 ч при 37°С (рис. 1); фрагмент клеток, обработанных в буфере D в течение 5 ч при 37°С (рис. 2); не подвергавшиеся обработке СХ (контроль) (рис. 3); обработанные в буфере D в течение 5 мин при 100°С (рис. 4 и 5); обработанные в буфере D-2 в течение 5 ч при 37°С (рис. 6 и 7); обработанные сначала в буфере D в течение 5 ч при 37°С, а затем - микрококковой нуклеазой (рис. 8 и 9); обработанные в буфере D дважды по 6 мин при 100°С (рис. 10). Обозначения см. в подписи к рис. 12.
Рис. 2.
(МС), обладающие трехслойным профилем (рис. 9), однако в связи с их мелкими размерами (~65 А на поперечных срезах) их нельзя отнести к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.