МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 80, № 3, с. 344-348
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.21.05
ИЗМЕНЕНИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ КЛЕТОК УАЯЮЦ'М 11Р01УТ1СА
В СТРЕССОВЫХ УСЛОВИЯХ
© 2011 г. Е. Н. Бирюкова1, *, А. Ю. Аринбасарова*, Н. Е. Сузина*, В. В. Сорокин,** А. Г. Меденцев*
*Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им Г.К. Скрябина РАН, Пущино ** Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва
Поступила в редакцию 13.05.2010 г.
Проведено исследование ультраструктурной организации аэробных дрожжей Уаттота Нро1уйса в условиях окислительного, теплового и этанольного стрессов. Показано, что, независимо от вида стрессового воздействия, происходили однотипные изменения ультраструктуры клеток: увеличение размеров митохондрий, повышение численности и размеров пероксисом, а также появление липидных гранул. Подобные изменения ультраструктуры имели место также при переходе клеток в стационарную фазу роста. Впервые показано, что в качестве стрессового ответа у дрожжей происходит накопление полифосфатных гранул. Отмечено также, что при окислительном или тепловом стрессе на поверхности клеточной стенки происходило появление множества глобулярных структур неизвестной природы. В случае этанольного стресса клетки характеризовались наличием четко выраженных глубоких инвагинаций цитоплазматиче-ской мембраны. (Такие же изменения цитоплазматической мембраны отмечались у клеток, выращенных на этаноле). Изменения структуры клеточной оболочки, так же как и появление полифосфатных гранул, не наблюдались в стационарной фазе роста. Изменения ультраструктуры клеток в стрессовых условиях согласуются с полученными ранее данными по выживаемости, дыхательной активности и изменению уровня антиоксидантных систем.
Ключевые слова: дрожжи Уаттота Нро1уНса, ультраструктура, стресс.
Сравнительный анализ ультраструктурной организации клетки в различных модельных стрессовых условиях является удобным методологическим подходом для изучения механизмов адаптации к различным стрессовым воздействиям [1, 2].
В настоящее время практически полностью отсутствуют данные по изучению ультраструктуры дрожжевой клетки в условиях острого стресса (в течение короткого промежутка времени). Имеются лишь единичные сообщения о том, что у Saccharo-myces cerevisiae после мягкого теплового воздействия (37°С, 30 мин) происходит частичное сжатие ядра, формирование в митохондриях и цитоплазме элек-троноплотных частиц [3].
В предыдущих работах [4—7] было показано, что в условиях окислительного, теплового и этанольно-го стрессов изменяются физиологические параметры клеток: выживаемость, дыхание, активности антиоксидантных систем ферментов и др.
Целью настоящей работы являлось изучение ультраструктурной организации дрожжей Yarrowia li-polytica в процессе адаптации к условиям окислительного, теплового и этанольного стрессов.
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: biryukovae05@ram-bler.ru).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В работе изучались дрожжи Уаттота Иро1уИса ВКМ У-2378, полученные из ВКМ [4]. Культивирование осуществляли при 29°С в колбах объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды Ридер [4] с глюкозой (1%) или этанолом (1%) на качалке (200 об./мин). Рост дрожжей оценивали по оптической плотности (к = 540 нм). Клетки отмывали стерильной дистиллированной водой и ресуспендиро-вали в 50 мМ трис-фосфатном буфере (рН 7.0).
Условия окислительного стресса были смоделированы путем инкубирования клеток в присутствии Н2О2 (0.5 мМ), теплового стресса — при температуре 37°С; этанольного стресса — в присутствии этанола (5%) в течение 60 мин. Указанные стрессовые условия были подобраны ранее [4—7] как нелетальные, для повышения устойчивости (адаптации) клеток.
При изучении ультраструктуры клетки центрифугировали при 15000 g, осадок фиксировали в 1.5%-ном растворе глутарового альдегида в 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.2) при 4°С в течение 1 ч; трижды отмывали тем же буфером и дополнительно фиксировали в 1%-ном растворе 0804 в 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.2) в течение 3 ч при 20°С. После обезвоживания спиртом материал заключали в эпоксидную смолу Ероп 812. Ультратонкие срезы
Рис. 1. Ультратонкий срез клеток У. Иро1уИеа из экспоненциальной (а) и стационарной (б) фазы роста. Длина масштабной метки 1 мкм. Я — ядро, Яш — ядрышко, Кс — клеточная стенка, Цм — цитоплазматическая мембрана, Л — лизосо-ма, ЭР — эндоплазматический ретикулум, М — митохондрия, П — пероксисома, В — вакуоль, Лп — липиды, Гл — глобулярные структуры, ПФ — полифосфаты, Ин — инвагинации цитоплазматической мембраны.
монтировали на опорные сеточки, контрастировали в течение 30 мин в 3% растворе уранилацетата в 70% спирте и дополнительно контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу [8]. Ультратонкие срезы просматривали в электронном микроскопе JEM-100B ("JEOL", Япония) при ускоряющем напряжении 80 кв.
Для проведения рентгеновского микроанализа элементного состава тонкие срезы клеток без дополнительного контрастирования монтировали на медные опорные сеточки, покрытые формваровой пленкой-подложкой и напыляли углеродом под углом 90°. Рентгеновский микроанализ срезов осуществляли с помощью электронного микроскопа JEM-100CXII ("JEOL", Япония), снабженного сканирующей приставкой EM-ASID4D и рентгеновским микроанализатором LINK-860 с детектором E5423 ("Link-System", Англия) при увеличении 20 тыс. и напряжении 60 кэВ. Рентгеновские спектры обрабатывали с помощью компьютерной программы ZAF/P [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как показано на рис. 1а (контрольный вариант), клетки Y. lipolytica в экспоненциальной фазе роста (на глюкозе, 1%) характеризуются гомогенной структурой цитоплазмы, в которой хорошо выявляются такие органеллы как ядро с ядрышком, вакуоль, лизосома, пероксисомы и мембраны эндоплазматического ре-тикулума. Митохондрии имеют небольшие размеры и располагаются преимущественно в периферической зоне цитоплазмы клетки.
Ранее [4—7] при изучении устойчивости дрожжей Y. lipolytica в условиях окислительного, теплового и этанольного стрессов были определены летальные условия, а также найдены пути повышения выживаемости клеток, в частности, мягкая тепловая "закалка", предобработка клеток нелетальными дозами
оксидантов или этанола. Было показано, что в процессе адаптации, независимо от стрессового фактора, в клетках происходит снижение содержания цАМФ, увеличение активностей антиоксидантных ферментов (каталазы, супероксиддисмутазы, глюкозо-6-фос-фатдегидрогеназы, глутатионредуктазы) и НАД+-за-висимой алкогольдегидрогеназы, а также появление альтернативного пути переноса электронов.
Кроме перестроек метаболической активности и антиоксидантного статуса клетки, в неблагоприятных условиях, естественно, можно было ожидать также изменения ультраструктурной организации клеток.
Действительно, в мягких стрессовых условиях, после воздействия стрессоров низкой дозы оксидантов (0.5 мМ Н2О2) (рис. 2а) или этанола (5%) (рис. 2 в), а также тепловой "закалки" (37°С, 60 мин) (рис. 2б), на ультратонких срезах клеток увеличивается количество пероксисом, располагающихся по периферии цитоплазмы. Митохондрии в этих условиях характеризовались более крупными размерами и плотным мат-риксом с большим количеством крист по сравнению с контролем. После любого из указанных стрессовых воздействий на ультратонких срезах клеток можно видеть также крупные электронопрозрачные гранулы липидов, отсутствующие в контроле.
Следует отметить, что все обнаруженные изменения ультраструктуры имели место также после перехода клеток в стационарную фазу роста.
Как было показано ранее [4—7], клетки У. ИроуНеа из стационарной фазы роста были более устойчивы ко всем стрессорам, чем клетки из экспоненциальной фазы. При этом был показан более высокий уровень активности антиоксидантных ферментов (в 2—3 раза), активности альтернативной оксидазы (в 5 раз), что, в частности, показывает адаптационный потенциал клетки, обеспечивающий выживание.
Во всех указанных стрессовых условиях имело место изменение структуры поверхности клеточной
346
БИРЮКОВА и др.
Рис. 2. Ультратонкий срез клеток Т. Иро1уИса в стрессовых условиях. а — 0.5 мМ Н2О2, 60 мин; б — 37°С, 60 мин; в — 5% этанол, 60 мин, (в' — фрагмент ультратонкого среза в). Длина масштабной метки 1 мкм. Обозначения как на рис. 1.
стенки. В случае окислительного или теплового стрессов на поверхности клеточной стенки происходило появление множества глобулярных структур неизвестной природы (рис. 2а, 2в). В случае этаноль-
20
15
10
5
СИЮ 0_1_2_3_
Рис. 3. Рентгеновский спектр электроноплотной гранулы в лизосоме клетки У. Нро1уНса (регистрируется фосфор).
ного стресса (рис. 2в) клетки характеризовались наличием четко выраженных глубоких инвагинаций цитоплазматической мембраны и полным отсутствием глобулярных структур на внешней поверхности клеточной стенки. Такие же изменения организации оболочки отмечались у клеток, выращенных на этаноле (на рисунке не показано).
Оказалось, что перечисленные выше изменения клеточной стенки (появление множества глобулярных структур или мембранных инвагинаций) не были обнаружены у клеток из стационарной фазы роста (как ранней, так и поздней).
Кроме того, следует особо отметить появление в стрессовых условиях электроноплотных гранул, имеющих высокое структурное сходство с внутриклеточными гранулами полифосфатов, описанными ранее у бактерий из морских осадков [9].
С целью изучения элементного состава этих включений был проведен рентгеновский микроанализ тонких срезов. Результаты представлены на рис. 3 и 4. Оказалось, что рассматриваемые включения содержат элемент фосфор, что однозначно свидетельствует в пользу того, что электроноплотные внутрицитоплаз-матические включения действительно являются полифосфатами.
Было показано, что полифосфатные гранулы обнаружены в лизосомах и в цитоплазме. Включения, обнаруженные в цитоплазме, имеют более низкую
электронную плотность и содержат элемент хлор (рис. 4). Во включениях полифосфатов, локализованных в лизосомах, хлор не выявлялся (рис. 3). Эти данные указывают
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.