БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 5, с. 528-540
УДК 612.017.11:577.112.013
ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА СЕМЕЙСТВА 70 кДа В НЕЙТРОФИЛАХ ЧЕЛОВЕКА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ТЕПЛОВОГО ШОКА
© 2014 г. А. А. Бойко*, С. С. Ветчинин**, А. М. Сапожников*, Е. И. Коваленко*, #
*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **ФБУН "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, пос. Оболенск Поступила в редакцию 10.12.2013 г. Принята к печати 18.03.2014 г.
Изучены изменения в содержании конститутивного и индуцируемого белков семейства белков теплового шока 70 кДа (HSP70), вызванные тепловым шоком, в человеческих нейтрофилах — лейкоцитах с нетипично коротким периодом жизни, обеспечивающих в организме неспецифическую защиту от бактериальных патогенов. При анализе внутриклеточного содержания конститутивного и индуцируемого белков HSP70 методом проточной цитометрии в нейтрофилах была выявлена двухфазная динамика изменения уровня белка, характеризующаяся их увеличением непосредственно после теплового шока и последующим снижением этого уровня в течение 15—30 мин после завершения термического воздействия. Поскольку ингибитор белкового синтеза циклогексимид не приводил к изменению регистрируемого профиля динамики, сделано заключение, что увеличение уровня HSP70 не связано с синтезом этих белков de novo, но может быть обусловлено изменением конформации молекул HSP70 и увеличением доступности определенных эпитопов для связывания с антителами. С помощью панели антител, специфичных к Ж-концевому АТР-связывающему либо С-концевому суб-стратсвязывающему доменам белка, удалось показать, что ассоциированное с тепловым шоком возрастание внутриклеточного уровня HSP70, детектируемое с помощью методов клеточной иммуно-флуоресценции и проточной цитометрии, обусловлено увеличением эффективности связывания антител, распознающих субстратсвязывающий домен. Также продемонстрировано, что снижение внутриклеточного уровня HSP70, наблюдаемое после теплового шока, может быть частично обусловлено выбросом во внеклеточное пространство как конститутивного, так и индуцируемого белков HSP70, регулируемым с участием ABC-транспортеров.
Ключевые слова: нейтрофилы, клеточный стресс, белки теплового шока 70 кДа, Шр70, Шс70, тепловой шок.
DOI: 10.7868/S0132342314050042
ВВЕДЕНИЕ
Нейтрофилы составляют преобладающую популяцию циркулирующих лейкоцитов крови и обеспечивают первый ответ организма на бактериальные и грибковые инфекции. Участие ней-трофилов в защитных реакциях опосредует их двоякую роль в организме: с одной стороны, они осуществляют элиминацию патогена и клиренс
Сокращения: МкАТ — моноклональные антитела; ТШ — тепловой шок; ВРБ8 — Дульбекко фосфатно-солевой раствор, рН 7.4; №с70 — конститутивный белок теплового шока семейства 70 кДа; №р70 — индуцируемый белок теплового шока семейства 70 кДа; Н8Р70 (Н8РЛ) — семейство белков теплового шока 70 кДа.
#Автор для связи (тел.: +7 (495) 330-40-11; эл. почта: lenkovalen@mail.ru).
поврежденных тканей, а с другой, усугубляют воспалительные реакции, связанные, в том числе, с избыточной продукцией активных форм кислорода и высвобождением содержимого гранул с агрессивными антимикробными компонентами, которые оказывают повреждающее влияние не только на мишени, но и на собственные ткани, включая сами клетки-продуценты. Несмотря на то, что нейтрофилы являются коротко-живущей популяцией лейкоцитов, в них представлены несколько уровней защиты от негативного действия, основанных на разнообразных химических, ферментативных и иных защитных реакциях [1—4].
Как и во всех эукариотических клетках, в ней-трофилах, несмотря на их низкую биосинтетическую активность, синтезируются белки теплового шока семейства 70 кДа (HSP70), одного из наиболее полно исследованных семейств белков теплового шока [5]. Белки HSP70 обладают широким спектром шаперонных функций и обеспечивают нормальное протекание многих внутриклеточных процессов, а также участвуют в защите клетки от стресса, в частности, препятствуют белковой агрегации и способствуют элиминации белков, поврежденных в условиях стресса. Согласно номенклатуре HUGO Gene Nomenclature Committee, семейство HSP70, или HSPA, человека состоит из 15 членов, имеющих молекулярные массы в области 66—78 кДа и кодируемых разными генами. Основными и, как следствие, наиболее изученными стрессиндуцируемыми продуктами генов этого семейства являются белки HSPA1A и HSPA1B, различающиеся двумя аминокислотными остатками и обладающие, вероятнее всего, идентичными функциями [6]. В литературе чаще всего эти белки обозначают как Hsp70. К конститутивно экспрессируемым протеинам семейства HSP70 относят органеллоспецифические белковые изоформы, а также белок HSPA8, чаще встречаемый в литературе под аббревиатурой Hsc70. Считается, что конститутивные и индуцируемые белки HSP70 различаются по характеру синтеза в клетке, который в свою очередь зависит от ее специализации и функциональной нагрузки. Это положение относится и к базовому уровню экспрессии белков, который тоже зависит от того, в каком организме и в каких типах клеток они синтезируются [7].
Разные виды клеточного стресса приводят не только к увеличению внутриклеточного содержания HSP70, но и в ряде случаев индуцируют транслокацию этих белков на плазматическую мембрану и/или высвобождение во внеклеточное пространство [8]. Установлено, что повышение уровня циркулирующих HSP70 в крови способствует выживанию клеток в условиях стресса [9, 10]. Показано, что у здоровых людей в ответ на физические нагрузки происходит увеличение количества циркулирующего Hsp70 [11, 12]. Вместе с тем выявлен ряд заболеваний, при которых достоверно повышена концентрация Hsp70 в сыворотке крови по сравнению со здоровыми людьми [13]. Эти данные указывают на то, что высвобождение клетками HSP70 может рассматриваться в контексте патологического процесса при заболевании, но также является частью нормального адаптивного ответа на стресс, вызванного физиологическими или физическими факторами, либо эндогенными сигналами. Показано, что внеклеточные HSP70 обладают различными иммунорегуляторными свойствами, в том числе выступают в роли шапероки-
нов, проявляя свою активность не только в качестве шаперонов, но и цитокинов [14]. В зависимости от окружающих их клеток ЖР70 могут действовать как иммуностимулирующие или им-муносупрессивные молекулы [15]. Преобладающее большинство литературных данных, освещающих внеклеточные И8Р70, относится к индуцируемому белку Шр70. В то же время в ряде публикаций описана секреция и конститутивного белка - №с70 [16-18].
Проблемам, связанным с различными аспектами экспрессии и роли И8Р70 в функционировании нейтрофилов, посвящены работы ряда авторов [19, 20]. Однако до сих пор у исследователей нет однозначного понимания того, в каких процессах в нейтрофилах принимают участие белки И8Р70, с какими внутриклеточными событиями взаимосвязано изменение их экспрессии и внутриклеточного содержания, и какая основная функциональная нагрузка лежит на пуле внутриклеточных И8Р70 у нейтрофилов, имея в виду нетипично короткий период жизни и узкую направленность их иммунной специализации. Одной из характерных особенностей этой короткоживущей разновидности клеток иммунной системы является их быстрая миграция в очаги воспаления, в которых они часто подвергаются действию гипертермического и окислительного стресса. В задачу данной работы входило изучение динамики стрессиндуци-рованных изменений содержания И8Р70 в нейтро-филах человека под действием теплового шока (ТШ), а также исследование факторов, влияющих на изменение внутриклеточного содержания этих белков. Детальному анализу была подвергнута динамика изменения уровня как индуцируемого Шр70, так и конститутивного Шс70 белков семейства И8Р70 в нейтрофилах.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе исследований была определена динамика содержания белков теплового шока семейства И8Р70 в нейтрофилах человека в ответ на клеточный стресс. Известно, что кинетический профиль внутриклеточного содержания И8Р70 в клетках сильно зависит не только от типа клеток, но и от интенсивности и продолжительности стрессирующего воздействия [5, 21]. В качестве модели клеточного стресса в данной работе был использован кратковременный ТШ, который проводили при 43°С в течение 10 мин. Такие условия ТШ существенно не влияли на жизнеспособность нейтрофилов. Об этом свидетельствовало отсутствие достоверных различий в содержании погибших (Р1-позитивных*) клеток между образцами, содержащими интактные ли-
* PI — пропидия иодид.
бо подвергнутые ТШ нейтрофилы, через 4 ч после завершения тепловой обработки (данные не представлены). Внутриклеточный уровень HSP70 определяли до ТШ (t = 0) и в момент завершения ТШ, затем анализировали изменение этого уровня через 15, 30 и 60 мин и далее через каждый час до 7 ч. Уровень HSP70 оценивали также в более поздние сроки (15—17 ч после окончания ТШ).
Детекция внутриклеточных HSP70 была проведена с использованием иммунофлуоресцентно-го окрашивания моноклональными антителами (МкАТ) BRM-22, специфичными к консервативному участку белков семейства HSP70 (распознающими Hsp70 и Hsc70), с последующим анализом клеток методом проточной цитометрии. Авторы многих работ регистрируют стрессиндуцированное увеличение внутриклеточного количества белков HSP70 с учетом периода восстановления клеток, длительность которого, в зависимости от типа и условий обработки клеток, может варьировать от нескольких минут до нескольких суток [5, 21—23]. В выбранной модели клеточного стресса нам с помощью метода проточной цитометрии не удалось выявить достоверного увеличения внутриклеточного содержания HSP70 в нейтрофилах в промежуток времени между одним и семью часами, а также через 15 ч после ТШ (рис. 1а). Вместе с тем, в момент прекращения термического воздействия в нейтрофилах регистрировалось значительное
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.