БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2015, № 1, с. 93-97
ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ ГИДРОБИОНТОВ
УДК 612.014.49;591.1:574
ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ СЕРОТОНИН-МОДУЛИРУЕМОГО БЕЛКА И ЦИТОХРОМА Р-450 В ТКАНЯХ ВОСТОЧНОЙ БЫСТРЯНКИ (Alburnoides bipunctatus eichwaldii (Filippi, 1863)) И КАВКАЗСКИХ РЕЧНЫХ БЫЧКОВ (Neogobius constructor (Nordmann, 1840)) © 2015 г. Н. Дж. Мустафаев*, А. А. Мехтиев**
*Институт зоологии НАНАзербайджана, AZ1073 Баку, проезд 1128, квартал 504, Азербайджан **Институт физиологии им. А.И. Караева НАН Азербайджана, AZ1100Баку, ул. Шариф-заде, 2, Азербайджан, e-mail: arifmekht@yahoo.com Поступила в редакцию 03.07.2013 г.
Изучены изменения уровней биомаркера цитохрома Р-450 и серотонин-модулируемого антиконсо-лидационного белка (СМАБ) в головном мозге, печени и жабрах восточной быстрянки (Alburnoides bipunctatus eichwaldii (Filippi, 1863)) и кавказских речных бычков (Neogobius constructor (Nordmann, 1840)), отловленных в реках Азербайджанской Республики, загрязненных промышленными выбросами. Уровни обоих белков в тканях рыб определяли методом непрямого иммуноферментного анализа. Оба показателя (особенно СМАБ) имели различный характер изменений в тканях быстрянки и бычков, что, по-видимому, связано с различными экологическими особенностями этих видов.
Ключевые слова: цитохром Р-450, серотонин-модулируемый антиконсолидационный белок, восточная быстрянка, кавказские речные бычки, непрямой иммуноферментный анализ, головной мозг, печень, жабры.
DOI: 10.7868/S0320965214040317
ВВЕДЕНИЕ
Влияние промышленного загрязнения окружающей среды на уровень различных видов биомаркеров в тканях животных — объект пристального изучения не только физиологов, но и экологов, занимающихся мониторингом зон возможного загрязнения. Применяемые в этих целях биомаркеры — довольно чувствительные индикаторы негативного влияния неблагоприятных факторов окружающей среды различной природы на функционирование органов и тканей животных разных видов, обитающих в границах конкретных ареалов [9—13]. Наряду с общепринятыми биомаркерами появляются новые, позволяющие оценить степень воздействия неблагоприятных факторов на механизмы мутагенеза. В частности, к таковым относится серотонин-модулируемый антиконсолидационный белок (СМАБ), выделенный ранее в Институте физиологии им. А.И. Караева НАН Азербайджана из мозга крыс, находящийся в прямой зависимости от уровня серотонина и лишенный тканевой и видовой специфичности [3]. Обнаружено, что уровень СМАБ в тканях рыб уменьшается под влиянием нефтяного и промышленного загрязнения [4], причем это измене-
ние носит не сопутствующий характер, а отражает состояние антимутагенных и антитоксических ресурсов организма [5, 6].
Рассматривая проблему определения уровня неблагоприятного воздействия окружающей среды на живые организмы с помощью биомаркеров, следует принимать во внимание экологические особенности различных видов исследуемых животных, находящихся в идентичных условиях обитания (водной, воздушной или наземной среды обитания), поскольку они могут вносить существенные коррективы в характер влияния неблагоприятных факторов.
Цель работы — изучение уровня СМАБ и цитохрома Р-450 в тканях восточной быстрянки и бычков, отловленных в реках Азербайджана.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты выполнены на головном мозге, печени и жабрах восточной быстрянки (Alburnoides bipunctatus eichwaldii (Filippi, 1863)) и кавказских речных бычков (Neogobius constructor (Nordmann, 1840)), выловленных одновременно в одинаковых участках рек Пенсарчай, Акстафачай и Аракс,
Физико-химические показатели воды в исследованных реках
Показатель Пенсарчай Акстафачай Аракс
рН 7.5 8.1 8.4
Температура, °С 6.2 10.5 9.9
Мутность, мг/л 11.1 1.1 54
Электропроводность, См/м 0.2 0.876 1.23
Растворенный О2, мг/л 2.85 4.41 4.8
Загрязняющие вещества, мкг/мл:
фенол 0 0.4 0.3
РЬ (30) 2.02 0 0.32
Си (1) 0 8.82 7.42
N1 (100) 2.04 0.40 2.80
7п (500) 0.16 9.86 6.63
Мп (10) 22.16 4.85 36.11
Сг (50) 0.01 0.13 1.09
Сё (1) 0.87 0.109 0.016
Бе (500) 1.55 13.02 172
А1 (500) 0.88 27.12 156
Примечание. В скобках — ПДК.
протекающих в разных регионах Азербайджана. Морфометрические показатели восточной быст-
рянки: D III 6-9, A III 10-16, l.l. 438-1156; чешуя
тонкая, глоточные зубы 2.5-4.2 или 2.5-5.2, на вершине вытянут заметный крючок. Жаберные тычинки короткие, редко сидящие. Морфометрические показатели кавказского речного бычка: D VI-VII, I 16-19, A I 11-13, squ. 56-68. Тело удлиненное, вальковатое к хвосту, суживается и сжато с боков. Голова широкая, приплюснута сверху. Ширина головы заметно больше высоты. Ширина лба в 1.5 раза меньше диаметра глаза.
Рыб отлавливали 10-18 декабря для исключения влияния измененного уровня гормонов на исследуемые показатели. Сразу после отлова у животных извлекали головной мозг, печень и жабры и замораживали.
Уровень СМАБ и цитохрома Р-450 в тканях рыб определяли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа на полистироловых планшетах среднего уровня сорбции ("Sigma", Германия) [1]. При проведении анализа в качестве антигенов использовали суммарные белки головного мозга, печени и жабр быстрянки и бычков, экстрагированные в 0.05 М фосфатном буфере (рН 7.2-7.4), содержавшем 0.3 М NaCl, 5 мМ ЭДТА и 0.1%-ный тритон Х-100, и доведенные до концентрации 20 мкг/мл с помощью 0.1 М буфера трис-HCl (pH 8.6). Каждую пробу дублировали дважды и по завершении реакции вычисляли среднюю арифметическую. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд с использованием 0.01%-ного раствора Кумасси бриллиантового синего G-250 на длине волны 595 нм [8].
В качестве первых антител использовали кроличьи поликлональные иммуноглобулины к белку СМАБ или к цитохрому Р-450 ("StressGen Bioreagents Company", США), в качестве вторых антител — противокроличьи козьи иммуноглобулины с конъюгированной пероксидазой хрена ("Sigma", Германия). Визуализацию реакции осуществляли с помощью субстрата пероксидазы хрена — 0.05%-ного раствора ортофенилендиами-на в 0.05 М цитрат-фосфатном буфере (pH 4.5). Реакцию останавливали через 20 мин после нанесения субстрата в лунки путем добавления в каждую лунку по 50 мкл 3 М раствора NaOH (в случае СМАБ) или 2 М HCl (в случае цитохрома Р-450); результаты реакции считывали на фотометре для иммуноферментного анализа "Molecular Devices Spectra Max 250" ("MTX Lab Systems, Inc.", США) на длине волны 492 нм (длина волны сравнения 630 нм). Результаты исследования усредняли по группам и сравнивали по í-критерию Стьюдента.
Поликлональные иммуноглобулины к СМАБ получали в результате пяти или шестимесячной иммунизации кроликов, вводя подкожно по 300 мкг очищенного белка всегда в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда ("Sigma", Германия). Схема иммунизации была следующей: первые три инъекции с интервалом в 14 сут, затем по одной инъекции в 1 мес. Кровь забирали из ушной вены кролика через 10 сут после третьей и последующих инъекций, выделяли сыворотку и осаждали иммуноглобулины путем добавления равного объема 100%-ного раствора сульфата аммония.
В таблице приведены показатели воды и уровни загрязнения рек Пенсарчай, Акстафачай и Аракс [2].
ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ СЕРОТОНИН-МОДУЛИРУЕМОГО БЕЛКА 95
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Зона р. Пенсарчай считается свободной от промышленных и бытовых поллютантов [2]. Значения уровней цитохрома Р-450 и СМАБ в исследованных тканях быстрянки и бычков, отловленных в этой реке, принимали за контрольный уровень. С этим уровнем сравнивали уровни цитохрома Р-450 и СМАБ в исследованных тканях этих двух видов рыб из рек Акстафачай и Аракс. При этом уровень цитохрома Р-450 в головном мозге, печени и жабрах быстрянки из рек Акстафачай и Аракс имел сходную картину. В частности, в головном мозге, печени и жабрах быстрянки, отловленной в р. Акстафачай, он был достоверно ниже, чем у особей из р. Пенсарчай соответственно на 28, 74 и 30%, а у особей быстрянки, отловленных в р. Аракс, был соответственно на 18, 39 и 14% ниже контроля (см. рисунок). Уровень цитохрома Р-450 в головном мозге, печени и жабрах бычков, отловленных в р. Акстафачай, не имел достоверных отличий от контрольного, тогда как в этих тканях у рыб из р. Аракс он был соответственно на 23, 21 и 48% ниже контрольного (см. рисунок).
В печени быстрянки из р. Акстафачай наблюдалось резкое снижение (на 46%) уровня СМАБ, тогда как в печени этих рыб из р. Аракс, наоборот, отмечалось его повышение на 39% . В печени бычков из р. Акстафачай уровень СМАБ не отличался от контрольных значений, а в печени животных из р. Аракс он снижался на 26% (см. рисунок).
В жабрах быстрянки из р. Акстафачай уровень СМАБ не отличался от контрольного, однако в жабрах у рыб из р. Аракс отмечалось его двукратное увеличение. В жабрах бычков из р. Акстафа-чай, как и у быстрянки, он не изменялся, а у животных из р. Аракс в жабрах наблюдалось его снижение на 49% (см. рисунок).
Изменения уровня СМАБ в головном мозге быстрянки были сходными с таковыми в печени и жабрах. У особей из р. Акстафачай его уровень был одинаковым с контрольным, у особей из р. Аракс — увеличивался на 26%. Характер изменений уровня СМАБ в головном мозге бычков в значительной степени отличался от такового в печени и жабрах: у особей из р. Акстафачай его уровень хоть и не достоверно, но превышал контрольный, у бычков из р. Аракс он на 14% (см. рисунок) превосходил контрольные значения.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Уровень цитохрома Р-450 имел заметно различающийся характер изменений в печени и жабрах быстрянки и бычков, отловленных в реках Акстафачай и Аракс: если в указанных тканях быстрян-ки из р. Акстафачай отмечалось резкое снижение (особенно сильное — в печени) уровня цитохрома
Изменение уровня цитохрома Р-450 (а, б) и СМАБ (в, г) в тканях быстрянки (а, в) и бычков (б, г), отловленных в реках Пенсарчай (I), Акстафачай (II) и Аракс (III) Азербайждана: 1 — мозг, 2 — печень, 3 — жабры; "*" — р < 0.05, "**" -р < 0.01, "***" -р < 0.001. По оси ординат — оптические единицы поглощения.
Р-450, то в тканях бычков уровень цитохрома Р-450 достоверно не изменялся. Если в жабрах
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.