ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 463, № 1, с. 102-105
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, ^^^^^^^^^^^^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.353.2
ИЗМЕНЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И СОДЕРЖАНИЯ Шр70 И Шр90 В ПОПЕРЕЧНО-ПОЛОСАТЫХ МЫШЦАХ МЫШЕЙ ПОСЛЕ ЗО-СУТОЧНОГО КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА НА БИОСПУТНИКЕ "БИОН-М1"
© 2015 г. Ю. В. Грицына, З. Р. Абдусаламова, И. М. Вихлянцев, А. Д. Уланова, Б. С. Шенкман, З. А. Подлубная, член-корреспондент РАН И. Б. Козловская
Поступило 10.02.2015 г.
DOI: 10.7868/S0869565215190238
Белки теплового шока (Heat shock proteins — Hsp, именуемые часто шаперонами или стресс-белками) — это класс функционально сходных белков, экспрессия которых усиливается при повышении температуры или влиянии других стрес-сирующих клетку факторов [1, 2]. Hsp играют важную роль в процессах фолдинга полипептидной цепи вновь синтезированных белков, участвуют в процессах репарации или элиминации неправильно упакованных или денатурированных белков и выполняют другие функции [2, 3]. Известно, что развитие мышечной атрофии в условиях гравитационной разгрузки, сопровождающееся повышенной деградацией саркомерных белков, в частности тайтина (титина/коннекти-на) и небулина [4], приводит к снижению экспрессии генов и содержания Hsp70 и Hsp90 [5—7]. Напротив, показано, что повышенная экспрессия Hsp70 [6] или Hsp90 [7] в разгруженной m. so-leus крыс сопровождалась значительным уменьшением развития в ней атрофических изменений Результаты указанных выше исследований, а также данные о роли шаперона Hsp90 в поддержании стабильности молекул гигантского белка тайтина [8] позволяют предполагать, что Hsp70 и Hsp90 играют важную роль в развитии мышечной атрофии в условиях гравитационной разгрузки.
Институт теоретической
и экспериментальной биофизики
Российской Академии наук, Пущино Московской обл.
E-mail: vikhlyantsev@mail.iteb.ru
Дагестанский государственный университет,
Махачкала
Пущинский государственный естественно-научный институт, Московская обл. Институт медико-биологических проблем Российской Академии наук, Москва
В исследованиях, проведенных нами ранее в рамках проекта "БИОН-М1", у мышей после 30-суточного космического полета были зарегистрированы атрофические изменения в m. gastrocnemius и m. tibialis anterior, сопровождающиеся снижением содержания гигантских белков толстых и тонких нитей тайтина и небулина [9]. Вполне вероятно, что вклад в эти негативные изменения могло внести и снижение содержания белков теплового шока, в частности, Hsp70 и Hsp90.
Целью настоящей работы было изучение изменений экспрессии генов и содержания Hsp70 и Hsp90 в сердечной и скелетных (m. gastrocnemius, m. tibialis anterior, m. psoas) мышцах мышей после 30-суточного космического полета на биоспутнике "БИОН-М1".
Эксперименты были проведены на мышах-самцах линии C57BL/6N (питомник лабораторных животных "Пущино" филиала ИБХ РАН, г. Пущино, Московская обл.). Животные были разделены на две группы: "Полет" — мыши, находившиеся с 19 апреля по 19 мая 2013 г. в условиях космического полета на борту биоспутника "БИОН-М1" (n = 5), и "Контроль" - мыши, находившиеся в течение этого времени в виварии в условиях земной гравитации (n = 5). Даты и условия проведения полетного и контрольных наземных экспериментов опубликованы в работе [10]. В наших экспериментах были использованы образцы сердечной (левый желудочек) и скелетных (m. gastrocnemius, m. tibialis anterior и m. psoas) мышц. Образцы мышц животных полетной группы были взяты через 12 ч после приземления спутника. Образцы мышечной ткани были заморожены в жидком азоте, а потом хранились при -70°С. Выделение РНК из мышечной ткани (10 мг) проводили с использованием набора AurumTMTo-tal RNA Fatty and Fibrous Tissue Kit ("Bio-Rad", США), согласно протоколу изготовителя. Качество РНК определяли по сохранности 18S и 28S
ИЗМЕНЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И СОДЕРЖАНИЯ 103
Таблица 1. Праймеры, используемые для ОТ-ПЦР в реальном времени
Гены Прямой праймер Обратный праймер Номер последовательностей генов из базы данных GenBank Длина продукта ПЦР, п. н.
GAPDH 5'-CTACACTGAGGACCAGGTTG-3' 5'-AAGGTGGAAGAGTGG-GAGTT-3' GU214026.1 60
Hsp70a1a 5'-ACGCCAACGGCATCCTGAAC-3' 5'-TCTCCTCCTTGCTCAG-GCGG-3' NM_010479.2 102
Hsp90aa1 5'-AAATCCGTTACGAGAGCCTG-3' 5'-AATGGTCAGGGTTCG-GTCCT-3' NM_010480.5 101
Hsp90ab1 5'-AAGGAACGGGAGAAGGAGAT-3' 5'-TCCTCCTTATCTTCCTC-CTC-3' NM_08302.3 77
рРНК с помощью электрофореза в 1%-м агароз-ном геле. Концентрацию тотальной РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 ("NanoDrop Technologies", США). Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием обратной транскриптазы M-MLV ("Евро-ген", Россия) и стандартного праймера олиго-dT20 в течение 60 мин при 42°C. ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторе ДТ-322 ("ДНК-технология", Россия) c использованием Taq-полимеразы ("Евроген", Россия) и SYBR Green I ("Invitrogen", США) в качестве флуоресцентного красителя. Праймеры для Hsp были подобраны программой Vector NTI (табл. 1). В качестве референсного гена (housekeeping gene) использовали ген GAPDH. Изменение экспрессии генов Hsp рассчитывали по методу 2-ЛЛС? согласно [11], где Ct — пороговый цикл реакции или точка пересечения графика накопления ДНК и пороговой линии. Расчеты ААС, проводили по формуле ААС, = АС,(контроль) — АС,(полет), а каждое значение АС, рассчитывали по формуле АС, = С,№(кОШроль или полет)) - С,(GAPDH). С помощью Вестерн-блоттинга определяли содержание Hsp70 и Hsp90 в исследуемых мышцах. Использовали первичные антитела к Hsp70 и Hsp90alpha ("Proteintech Group", США, 1 : 1000), а также к Hsp90beta (1 : 1000, антитела были получены в лаборатории культур клеток и клеточной инженерии Института биофизики клетки РАН, Пущи-но). В качестве вторичных антител были использованы антитела, конъюгированные со щелочной фосфатазой (Proteintech Group, США, 1 : 1000). Более подробное описание методики представлено в работе [9]. Статистический анализ результатов проводили с использованием непараметрического критерия U Манна-Уитни.
Учитывая полученные нами ранее результаты о снижении содержания тайтина в атрофированной в условиях космического полета m. gastrocnemius мышей [9], а также данные о роли Hsp90 в поддержании стабильности молекул этого ги-
гантского белка [8], ожидалось обнаружить уменьшение содержания Hsp90 в икроножной мышце животных группы "Полет". Однако результаты Вестерн-блоттинга не выявили достоверных различий в содержании как Hsp90alpha, так и Hsp90beta в m. gastrocnemius мышей контрольной и полетной групп (данные не представлены). Аналогичные результаты были получены и для других исследуемых поперечно-полосатых мышц. Методом ОТ-ПЦР в реальном времени не было обнаружено изменений в экспрессии гена Hsp90 в сердечной мышце мышей групп "Контроль" и "Полет" (данные не представлены), тогда как в исследуемых скелетных мышцах (m. gas-trocnemius, m. tibialis anterior и m. psoas) мышей полетной группы обнаружено незначительное увеличение (в 1.2, в 1.3 и в 1.35 раза соответственно) уровня мРНК Hsp90, которое мы не считаемым значимым. Наши данные согласуются с результатами исследований, в которых не было выявлено достоверных различий в экспрессии генов трех белков теплового шока (Hsp27, Hsp70 и Hsp84) в m. plantaris крыс после 14-суточной моделируемой гравитационной разгрузки [12].
На рис. 1 представлены результаты исследования изменений экспрессии гена и содержания Hsp70 в поперечно-полосатых мышцах. Не обнаружено достоверных различий в содержании Hsp70 в m. tibialis anterior, m. psoas и сердечной мышце контрольных и полетных мышей, однако выявлено значительное снижение (в 2.35 ± 0.95 раза, p < 0.01) содержания этого белка в m. gastrocnemius мышей группы "Полет" (рис. 1). Вполне вероятно, что уменьшение содержания этого белка внесло свой вклад в развитие атрофических изменений, сопровождающихся повышенной деградацией тайтина и небулина в m. gastrocnemius мышей полетной группы [9]. Эти изменения, несомненно, будут приводить к нарушению сократительной способности мышцы, а также, учитывая многофункциональность Hsp70 [2, 3], могут сопровождаться и другими негативными последствиями.
104
ГРИЦЫНА и др.
AC, 15 г
10
M. gastrocnemius
iL
Контроль Полет
M. gastrocnemius
AC, 20
15
10
5
0
Контроль Полет
M. psoas
Контроль Полет
M. psoas
AC, 14
12
10
8
6
4
2
0
AC, 15
10
M. tibialis anterior
Контроль Полет
M. tibialis anterior
Контроль Полет
Левый желудочек
Контроль Полет
Левый желудочек
Контроль
Полет
Контроль
Полет
Рис. 1. Экспрессия гена (диаграммы, М± т) и содержание (данные Вестерн-блоттинга) №р70 в поперечно-полосатых мышцах мышей контрольной и полетной групп. Денситометрическую обработку Вестерн-блотов проводили с помощью программы ТЫа!ЬаЬ V. 1.11.
5
0
На фоне отсутствия достоверных изменений в содержании Hsp70 зарегистрировано снижение в 4.7 раза содержания его мРНК в сердечной мышце и увеличение в 2 раза содержания его мРНК в m. tibialis anterior и m. psoas мышей группы "Полет" (рис. 1). В m. gastrocnemius мышей полетной группы экспрессия гена Hsp70 была увеличена в 5.2 раза. Эти результаты согласуются с данными, свидетельствующими об увеличении экспрессии генов Hsp25 и Hsp72 в атрофированной m. soleus крыс и мышей после устранения моделируемой гравитационной разгрузки (в период реадаптации к земной гравитации) [13, 14]. По всей вероятности, обнаруженное нами увеличение экспрессии гена Hsp70 в скелетных мышцах мышей является ответом на стрессовые условия, возникшие во время спуска и приземления космического аппарата, а также в остром периоде реадаптации к земной гравитации (в течение 12 часов от посадки до взятия биоматериала). Более значительное увеличение экспрессии гена Hsp70 в m. gastrocnemius
мышей полетной группы может быть связано с восстановлением нормального содержания этого белка, сниженного в условиях космического полета (рис. 1).
Выражаем благодарность сотрудникам ГНЦ РФ - ИМБП РАН (Москва) и ОАО "РКЦ Прогресс" за подготовку и проведение всех экспериментов по проекту "БИОН-М1". Выражаем благодарность руководителю лаборатории культур клеток и клеточ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.