БИОФИЗИКА, 2011, том 56, вып. 1, с. 122-128
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ =
УДК 576.3
ИЗМЕНЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО ДЫХАНИЯ ВОЛОКОН ПОСТУРАЛЬНЫХ МЫШЦ КРЫСЫ В УСЛОВИЯХ ДЛИТЕЛЬНОЙ ГРАВИТАЦИОННОЙ РАЗГРУЗКИ ПРИ ДОБАВЛЕНИИ В РАЦИОН СУКЦИНАТА
© 2011 г. И .В. Огнева, О.М. Веселова, И .М. Ларина
ГНЦ РФИнститут медико-биологических проблем РАН, 123007, Москва, Xорошевское шоссе, 76а
E-mail: iogneva@yandex.ru Поступила в p едакцию 11.02.10 г. После доработки 29.04.10 г.
Исследована интенсивность клеточного дыхания волокон камбаловидной, икроножной и передней большеберцовой мышц крысы в условиях длительной 35-суточной гравитационной р азгр узки с добавлением в р ацион сукцината из р а счета 50 мг на 1 кг веса животного. Гравитационную разгрузку моделировали путем антиортостатического вывешивания задних конечностей. Животные, в пищу которых добавляли препарат, получали янтарную кислоту ежедневно per os. Интенсивность клеточного дыхания оценивали с помощью полярографии. Показано, что скорость потребления кислорода волокнами камбаловидной и икроножной мышц на эндогенных, экзогенных субстратах и при добавлении АДФ после разгрузки снижается, что может быть обусловлено переходом на гликолитический путь энер гообеспечения в связи с уменьшением ЭМГ-активности. При этом в волокнах камбаловидной мышцы скорость дыхания при добавлении экзогенных субстратов по сравнению с эндогенными не увеличивалась, что может свидетельствовать о нарушении работы NCCR-участка дыхательной цепи и более выраженных изменениях в структур е мышечных волокон. В волокнах передней большебер цовой мышцы изменений скорости потребления кислорода после разгрузки отмечено не было. Введение в рацион крыс сукцината позволяет предотвратить негативные последствия гипокинезии, хотя и снижает базальный уровень интенсивности клеточного дыхания.
Ключевые слова: клеточное дыхание, гравитационная разгрузка, постуральные мышцы, сукцинат.
Снижение сокр атительных возможностей постуральных мышц является одной из о снов-ных проблем, препятствующих длительным космическим полетам и снижающих скор ость восстановления тр авматологических и невр ологи-ческих больных. Негативные последствия длительной функциональной разгрузки обусловлены, в пер вую очередь, атрофическими изменениями мышечных волокон, которые могут наблюдаться, например, уже к седьмым суткам пребывания в условиях реальной или моделируемой микрогравитации [1—3]. Развитие атрофии связано в первую очер едь с р аспадом ци-тоскелетных белков [4-6], индуцированным, по-видимому, увеличением концентрации ионов кальция [7,8] и активацией кальций-зависимых протеаз - кальпаинов [9]. До сих пор остается неясным механизм накопления ионов кальция в условиях функциональной разгрузки, но по
Сокращения: ДТТ - дитиотреитол, ЭМГ - электромиография, БСА - бычий сывороточный альбумин, ДК -дыхательный контроль.
некоторым данным [10] это коррелирует с изменением электрогенных свойств мембраны мышечных волокон и может быть связано с ЭМГ-активностью мышцы.
Так, в работе [11] показано, что динамика изменения ЭМГ-активности у флексоров и экстензоров голени крысы в условиях гравитационной разгрузки существенно неодинакова. По данным авторов этой работы в камбаловидной мышце кр ысы ЭМГ-активность снижается до 9% от уровня контр оля уже к первым суткам пребывания в условиях антиортостатического вывешивания, начинает восстанавливаться к тр етьим суткам и к двухнедельному сроку достигает уровня контроля, даже несколько превышая его к месяцу разгрузки (110% от уровня контр оля). Динамика ЭМГ-активности икроножной мышцы аналогична вышеописанной, однако в пер вые сутки р азгрузки снижение не столь значительно (до 54% от исходного уровня), но и к месяцу вывешивания ур овень ЭМГ составляет лишь 80% от контр оля. П р и этом ЭМГ-активность передней большеберцовой
мышцы в условиях разгрузки существенно выше, нежели в контр оле, причем уже в первые сутки вывешивания превышает его на 243%, а к тридцатым суткам - на 150%.
В свою очередь изменение ЭМГ-активности мышцы в условиях функциональной разгрузки приводит к модуляции ее энергообмена. Так, авторы р абот [12,13] пр и анализе внутриклеточного содержания энергетических субстратов показали, что в медленных волокнах камбало-видной мышцы содер жание триглицеридов через 3 и 14 дней антиорто статического вывешивания не изменилось, в то время как в быстрых волокнах к двухнедельному ср оку существенно снизилось. При этом в волокнах обоих типов передней большеберцовой мышцы имело место накопление триглицеридов к двум неделям гравитационной р азгрузки. В то же время содержание гликогена как в медленных, так и в быстрых волокнах камбаловидной и передней большеберцовой мышц через 3 дня вывешивания достовер но уменьшило сь, а через 14 дней вернулось к уровню контроля. По-видимому, наблюдавшиеся авторами изменения могут быть связаны с изменениями фенотипа мышечных волокон в условиях гравитационной разгрузки: имеет место сдвиг миозинового фенотипа в быструю стор ону [14,15] и, как следствие увеличение р оли гликолитического пути.
Изменение типа энергообмена в мышечных волокнах должно приводить к изменению скорости клеточного дыхания как терминальной стадии в цепи синтеза высокоэнергетических фосфатов (АТФ). Так, в работе [16] показано, что чер ез 28 дней антиорто статического вывешивания скор ость синтеза АТФ, а также уровень сопряжения окисления и фосфор илир ова-ния в икр оножной мышце снижаются. Однако эти параметры в условиях гравитационной разгрузки изучены недостаточно, и в литературных источниках содержатся лишь единичные упоминания о работах, направленных на поиск средств предотвращения негативных изменений энергообеспечения мышцы в этих условиях.
В связи с вышеизложенным основной целью нашей работы являлось изучение параметров клеточного дыхания в волокнах камбаловид-ной, медиальной головки икроножной и передней большеберцовой мышц в условиях длительной функциональной разгрузки с пр именением в качестве дополнительного субстрата препарата янтарной кислоты.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использовали 28 половозрелых крыс-самцов пор оды массой 200-270 г, которые
были разделены на четыр е группы: «Контроль», «Вывешивание», «Контроль+янтарь», «Выве-шивание+ янтар ь». Животные групп «Контр оль» и «Вывешивание» содержались в вивар-ных условиях, получая стандартный корм и воду ad libitum. В группах «Контроль+янтарь», «Вывешивание+ янтарь» животные помимо стандартного корма и воды ad libitum получали препарат «янтарь-антитокс» per os в дозировке из расчета 50 мг янтарной кислоты на 1 кг массы животного.
Антиортостатическое вывешивание задних конечностей с целью моделирования гравитационной разгрузки в течение 35 сут проводили по стандартной методике Ильина-Новикова в модификации Morey-Holton [17].
Программа эксперимента и все манипуляции, выполняемые с животными, были одобрены комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ Института медико-биологических проблем РАН.
Материалом исследования служили волокна камбаловидной (m. soleus), медиальной головки икр оножной (m. gastrocnemius сар^ mediale) и пер едней большеберцовой мышц (m. tibialis anterior).
Оценка скорости клеточного дых ания методом полярографии. Мышцу вырезали от сухожилия до сухожилия и немедленно помещали в охлажденный раствор «А» (2,77 мМ CaK2EGTA, 7,23 мМ K2EGTA, 6,56 мМ MgCl26H2O, 0,5 мМ дитиотреитола (DTT), 50 мМ KM es, 20 мМ имидазола, 20 мМ таур ина, 5,3 мМ ATФ, 15 мМ фосфокреатина, рН 7,1), в котором ее разделяли на пучки мышечных волокон длиной 3-4 мм и толщиной около 1 мм. Далее волокна инкубировали в растворе «А» с сапонином (50 мкг/мл) в течение 30 мин пр и легком помешивании, при темпер атуре 4°С с целью частичного скинирования мембраны. Затем пучки волокон отмывали от сапонина в течение 10 мин в растворе «Б» (2,77 мМ CaK2EGTA, 7,23 мМ K2EGTA, 1,38 мМ MgCl2, 0,5 мМ DTT, 100 мМ KM es, 20 мМ имидазола, 20 мМ таурина, 3 мМ K2HPO4, рН 7,1).
^оро сть поглощения кислорода оценивали методом полярографии по Cаксу [18]. Пучки скинированных волокон инкубировали в растворе «Б», в который добавляли 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БCA), свободного от жирных кислот. В качестве экзогенных субстратов дыхательной цепи использовали смесь 5 мМ глутамата + 2 мМ малата, а для определения максимальной скорости дыхания вносили 5 мМ AДФ. Концентрацию кислорода измеряли с помощью электрода Кларка и ок-
Таблица 1. Параметры клеточного дыхания скинированных мышечных волокон m. soleus крысы
Группа Пар аметр ы
УэнпГ1, нг-ат О/с-мг УэкзГ1, нг-ат О/с-мг V ДДФ, нг-ат О/с-мг ДК
Контроль Вывешивание Контроль+янтарь Вывешивание+янтарь 1261 ± 229 482 ± 164* 579 ± 150* 582 ± 100* 1407 ± 336 557 ± 164* 975 ± 289 1054 ± 396 3182 ± 564 1753 ± 639* 2046 ± 293 2057 ± 429 2,5 ± 0,3 2,7 ± 0,4 2,1 ± 0,6 2,0 ± 0,3
Примечание. * - р < 0,05 по сравнению с группой «Контроль».
симетра YSI Model 53 Оху§еи Monitor (Yellow 8ргт§ Instrument Co., СШ A) при температур е 22°С. Растворимость кислорода в 1 мл среды инкубации при этой температуре принимали равной 460 нг-ат [19].
Определяли следующие дыхательные параметры: Уэндо - скорость поглощения кислорода на эндогенных субстратах, Уэкзо - скорость на экзогенных субстратах, Уддф - максимальная скорость дыхания. После измерений волокна извлекали из полярогр афической ячейки, высушивали при темпер атуре 95°С и затем взвешивали, что позволяло рассчитывать скоростные параметры, нормированные на 1 мг сухого веса. Дыхательный контр оль (ДК) р ассчитывали как соотношение скоро сти дыхания в присутствии АДФ к скорости дыхания на экзогенных субстратах.
Статистическая обработка. Данные в таблицах пр едставлены как средние значения ± стандартное отклонение (М ± SD). Достоверность различий между группами определяли с использованием two-way ANOVA. Достовер ными считали отличия с уровнем значимости р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Камбаловидная мышца. Результаты исследования параметров клеточного дыхания волокон камбаловидной мышцы крысы представлены в табл. 1. Как показывают данные табл. 1, скорость дыхания на эндогенных субстратах (Vэндо) в волокнах камбалови
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.