УДК 577.352.4
ИЗМЕНЕНИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО NAD(P)H И НАРУШЕНИЯ КАЛЬЦИЕВОГО ГОМЕОСТАЗА В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ НЕЙРОНАХ МОЗЖЕЧКА КРЫСЫ ПРИ ГИПЕРСТИМУЛЯЦИИ ГЛУТАМАТНЫХ
РЕЦЕПТОРОВ
© 2010 г. А. М. Сурин1, С. Н. Зобова13, Г. Р. Тухбатова2, Я. Е. Сенилова2,
В. Г. Пинелис2, Б. И. Ходоров1
НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва 125315, ул. Балтийская, 8;
2Научный Центр здоровья детей РАМН, Москва, 119991, Ломоносовский просп., 2/62;
3Красноярский Государственный медицинский университет им. Войно-Ясенецкого, Красноярск, 660022, ул. Партизана Железняка, 1 факс: +7(495) 151-1726; электронная почта: alexsurin@yahoo.com Поступила в редакцию 21.05.2009 г.
Проведено сопоставление изменений кальциевого гомеостаза и энергетического состояния митохондрий в культивируемых гранулярных нейронах мозжечка, подвергнутых действию нейротокси-ческих концентраций глутамата (Glu). Для этого были выполнены одновременные измерения флуоресценции низкоаффинного Са2+-индикатора Fluo-3FF, потенциал-чувствительного митохон-дриального зонда Rh123 и автофлуоресценции нейронов, обусловленной NAD(P)H. Обнаружено, что у 94% нейронов (205 клеток, 28 экспериментов) возникновению отсроченной кальциевой ди-срегуляции (ОКД) предшествовало более или менее продолжительное снижение NAD(P)H, которое у многих клеток (114/205 = 57%) усиливалось во время развития ОКД. На основании анализа изменений автофлуоресценции NAD(P)H, а также сигналов Fluo-3FF и Rh123 при действии Glu, ингибитора дыхательной цепи (NaCN) митохондрий и протонофора (FCCP) высказано предположение о том, что одной из причин падения NAD(P)H во время развития ОКД и в последующий период высокого [Ca2+]j плато может быть закисление митохондрий.
Ключевые слова: нейроны, митохондрии, глутамат, NADH, отсроченная кальциевая дисрегуляция.
Гибель нейронов при гипоксии/ишемии мозга обусловлена, главным образом, гиперстимуляцией ионотропных глутаматных рецепторов NMDA-типа, имеющих высокую Na+- и Са2+-проницае-мость. Массивный вход Са2+ по NMDA-каналам вызывает развитие отсроченной кальциевой ди-срегуляции (ОКД), которая характеризуется вторичным подъемом концентрации свободного внутриклеточного Са2+ ([Са2+];), происходящим синхронно с сильной митохондриальной деполяризацией (МД). Несмотря на многочисленные исследования (см. обзоры [1, 2]), механизмы этой МД и причины ее синхронности с ОКД окончательно не выяснены. Генерация митохондриаль-ного потенциала (AVm) осуществляется работой насосов дыхательной цепи, активность которых поддерживается NADH, вырабатываемым пиру-ватдегидрогеназой и тремя дегидрогеназами цикла трикарбоновых кислот. AVm обеспечивает синтез АТР и захват Са2+ митохондриями. Естественно было поэтому предположить, что возникновение ОКД и сильной МД при токсическом воздействии Glu на нервные клетки может
являться следствием Са-зависимых нарушений процессов производства и использования NAD(P)H в митохондриях этих нейронов. Действительно, применение метода регистрации автофлуоресценции NADH показало, что в культивируемых гиппокампальных нейронах возникновению ОКД при длительном действии Glu, как правило, предшествует падение NADH до некоторого критического уровня, необходимого для коллапса митохондриального потенциала [3].
В настоящей работе методы флуоресцентной микроскопии были применены для комплексного исследования динамики изменений [Ca2+]b AVm и суммарного уровня NADH и NADPH (NAD(P)H) во время токсического воздействия Glu на культивируемые гранулярные нейроны мозжечка. Как и в опытах на гиппокампальных нейронах [3], в наших экспериментах на культивированных клетках мозжечка падение уровня NAD(P)H в большинстве (94%) нейронов предшествовало возникновению ОКД. Мы, однако, не смогли подтвердить заключение Абрамова и Дучена [3] о том, что ОКД возникает только после
того, как NAD(P)H снижается до некоторого минимального уровня. В большей части мозжечковых клеток (57%) после добавления Glu сначала наблюдается умеренное снижение NAD(P)H, которое затем переходит во вторичное падение NAD(P)H, происходящее одновременно с ОКД. Высказано предположение, что одним из факторов, вызывающих падение NAD(P)H при развитии ОКД и последующем [Ca2+]¡ плато, является закисление матрикса митохондрий.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использованы первичные культуры гранулярных клеток из мозжечка крысы. Приготовление культур и растворов для проведения измерений описано ранее [4]. Для флуоресцентно-микроскопических измерений использовали клетки после 7—14 дней в культуре (7—14 ДВК). Для оценки изменений AVm применяли потенциал-чувствительный флуоресцентный зонд родамин 123 (Rh123) по методике, описанной ранее [5]. Измерения [Ca2+]¡ проводили с помощью низкоаффинного флуоресцентного Ca2+ индикатора Fluo-3FF, позволяющего адекватно регистрировать изменения [Ca2+] в микромолярном диапазоне концентраций. Индикатор вводили в клетки в форме ацетоксиметилового эфира (1—2 мкМ, 50—60 мин, 23—25°С), смешанного с неионным детергентом Pluronic F-127 (0.02%). Для возбуждения и регистрации флуоресцентных сигналов Rh123 и Fluo-3FF использовали светофильтры 488 ± 8 нм и 530 ± 20 нм. Для возбуждения и регистрации флуоресценции NAD(P)H применяли светофильтры 360 ± 8 нм и 460 ± 20 нм. Для одновременного измерения сигналов Fluo-3FF и NAD(P)H, или Rh123 и NAD(P)H использовали трехполосное зеркало TFT 440-500-570 ("Chroma", США). При регистрации слабой автофлуоресценции нейронов время накопления сигнала NAD(P)H составляло 2—3 с при биннинге камеры 4 x 4 или 8 x 8 и использовании соответственно 40- или 63-кратного объектива. Величины сигналов NAD(P)H и Rh123, соответствующие минимальному уровню NAD(P)H и максимальной МД, определяли в конце эксперимента, добавляя протонофор FCCP (1 мкМ).
Система регистрации сигналов индивидуальных клеток включала 175 Вт ксеноновую лампу ("Sutter Instrument", США), инвертированный флуоресцентный микроскоп Axiovert-200 ("Zeiss", Германия) и 12-битную охлаждаемую CCD камеру SnapCool-fX ("Roper Scientific", США). Изображения обрабатывали с помощью программ MetaFluor и MetaFluor Analyst ("Molecular Device Corporation", США).
Измерения выполняли при температуре предметного столика микроскопа 28—32°С в буфере, содержащем faM): 145 NaCl, 5.4 KCl, 1.8 CaCl2,
1 MgCl2, 5 ¿»-глюкозы; 20 HEPES, pH 7.4. Буферные растворы с глутаматом и ингибиторами готовили непосредственно перед применением. Все реактивы фирмы "Sigma", флуоресцентные индикаторы и Pluronic F-127 — фирмы "Invitrogen" (США).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Изображения покоящихся нейронов демонстрируют преимущественную автофлуоресценцию цито-золя, обусловленную суммарным свечением NADH и NADPH (NAD(P)H) и совпадающую с распределением флуоресценции митохондриального потенциал-чувствительного зонда Rh123 (рис. 1). В совокупности с данными о чувствительности автофлуоресценции к митохондриальным ядам (рис. 2 и 3) это свидетельствует о доминирующем вкладе митохон-дриального NADH в изменения суммарной автофлуоресценции [6].
Кратковременное добавление ингибитора дыхательной цепи цианида натрия (CN, 3 мМ) к покоящимся клеткам не влияло на [Ca2+] , но вызывало быстрый обратимый подъем автофлуоресценции нейронов (рис. 2). CN индуцировал почти двукратный (1.81 ± 0.33, n = 24) рост NAD(P)H относительно базального уровня, что на 13% выше прироста, вызванного остановкой ATP-синтазы с помощью олигомицина (не показано). Это свидетельствует о том, что в митохондриях покоящихся нейронов синтез ATP происходит достаточно интенсивно, и согласуется с данными работы [7], в которой показано, что в покоящихся гранулярных нейронах мозжечка затраты кислорода на синтез ATP составляли 51% от максимального уровня потребления. Отсутствие изменений [Ca2+]j говорит о том, что 5—10 мин ингибирова-ние дыхательной цепи не изменяет равновесия между входящими в цитозоль и выходящими из него потоками Са2+.
При добавлении Glu (100 мкМ) сначала происходит небольшое увеличение [Ca2+] (рис. 2), которое всегда сопровождается небольшой МД (не показано; однако см. [2] и ссылки там). При продолжительном воздействии Glu нейроны теряют способность удерживать [Ca2+] на относительно низком уровне, и возникает ОКД и сильная МД, которые переходят в устойчивое [Ca2+] плато и МД. Как отмечалось выше, характерной особенностью ОКД является то, что рост [Ca2+] и наступление сильной МД всегда происходят синхронно [2]. Изменения NAD(P)H имели более сложный характер и не всегда были синхронны с изменениями [Ca2+] (рис. 2). Клетки, в которых ОКД наступала через 15—20 и более минут после добавления Glu, демонстрировали сначала подъем флуоресценции NAD(P)H (рис. 2а), связанный, по-видимому, с Са-зависимой активацией митохондриальных дегидрогеназ [8]. Затем насту-
280 240 200
« s
X
<D . „
До 190 120
о ^
<D .
о СО
^ S
ew
160
80 40
280щ
£ d
200 ^ я
s I
160i si
^ со Л о
О PQ
I
- 80
20 40 60 80 100 Расстояние, отн. ед.
140
0
Рис. 1. Флуоресцентные изображения клеток, полученные после окрашивания (а) митохондриальным потенциал-чувствительным зондом Rh123 и при регистрации (б) автофлуоресценции, обусловленной суммарным излучением NADH и NADPH (NAD(P)H). в — Распределение интенсивностей флуоресценции Rh123 (сплошная линия) и NAD(P)H (пунктирная линия) вдоль сечения, выделенного отрезком на а и б, для одного из нейронов, отмеченного на изображениях а и б стрелкой. Масштабный горизонтальный отрезок соответствует 10 мкм (а).
пало относительно плавное снижение МЛО(Р)И, причем вторичный подъем [Са2+] наступал только тогда, когда уровень МЛО(Р)И опускался до
минимального или близкого к нему (рис. 2а). Доля нейронов с подобным типом изменений МЛО(Р)И составляла 37% (76 из 205 клеток,
CN
1000 1500 2000 2500 3000 Время, с
Рис. 2. Изменения [Ca2+]j и митохондриального NAD(P)H в трех представительных гранулярных нейронах из мозжечка крысы. Изменения флуоресценции Са2+ индикатора Fluo-3FF (сплошные линии) и NAD(P)H (пунктир) нормированы относительно их первоначальных значений в покоящихся нейронах. Флуоресценцию Fluo-3FF (левые шкалы ординат) возбуждали и регистрировали соответственно при 488 ± 8 нм
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.