МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 6, с. 915-926
ГЕНОМИКА.
ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 577.21
ИЗМЕНЕНИЯ ПРОФИЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПРИ НЕСОВМЕСТИМОМ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ МЕЖДУ Lilium regale Wüson И Fusarium oxysporum f. sp. lilii, ВЫЯВЛЕННЫЕ МЕТОДАМИ СУПРЕССИОННОЙ ВЫЧИТАЮЩЕЙ ГИБРИДИЗАЦИИ И АНАЛИЗА НА ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ МИКРОМАТРИЦАХ*
© 2014 г. J. Rao, D. Liu*, N. Zhang, H. He, F. Ge, C. Chen
Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming, 650500, China
Поступила в редакцию 14.01.2014 г.
Принята к печати 28.04.2014 г.
Фузариозное увядание, вызываемое почвенным патогенным грибом Fusarium oxysporum f. sp. lilii, — одно из основных заболеваний лилий (Lilium L.). С целью определения набора генов Lilium regale Wilson, уровень экспрессии которых изменяется в ответ на заражение F. оxysporum, создана библиотека кДНК из клеток корня L. regale, инфицированного F. оxysporum. С помощью супрессионной вычитающей гибридизации (SSH) выявлено 585 уникальных EST. Изменения профиля экспрессии генов L. regale при несовместимом взаимодействии L. regale и F. oxysporum обнаружены также при помощи анализа на олигонуклеотидных микроматрицах — полученные 585 EST сравнивали с кДНК восточно-гибридной лилии сорта 'Siberia', восприимчивой к F. oxysporum. Анализ профилей экспрессии показал, что в реакции раннего ответа L. regale на инфицирование F. oxysporum вовлечены гены, кодирующие белки, связанные с патогенезом (PR), антиокси-дантные ферменты и ферменты, вовлеченные в процессы вторичного метаболизма, факторы транскрипции, сигнальные белки, а также большое число генов с неизвестными функциями. При помощи количественной ОТ-ПЦР подтверждена правильность анализа на олигонуклеотидных микроматрицах. В представленной работе выявлены гены L. regale, экспрессия которых изменяется при взаимодействии с F. oxysporum, что помогает понять молекулярный механизм, определяющий устойчивость L. regale к F. oxysporum.
Ключевые слова: Lilium regale Wilson, защитный механизм, Fusarium oxysporum f. sp. lilii, анализ на олигонуклеотидных микроматрицах, супрессионная вычитающая гибридизация.
DIFFERENTIAL GENE EXPRESSION IN INCOMPATIBLE INTERACTION BETWEEN Lilium regale Wilson AND Fusarium oxysporum f. sp. lilii REVEALED BY COMBINED SSH AND MICROARRAY ANALYSIS, by J. Rao, D. Liu*, N. Zhang, H. He, F. Ge, C. Chen (Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming, 650500, China; *e-mail: diqiuliu@126.com). Fusarium wilt, caused by a soilborne pathogen Fusarium oxysporum f. sp. lilii, is the major disease of lily (Lilium L.). In order to isolate the genes differentially expressed in a resistant reaction to F. oxysporum in L. regale Wilson, a cDNA library was constructed with L. regale root during F. oxysporum infection using the suppression subtractive hybridization (SSH), and a total of 585 unique expressed sequence tags (ESTs) were obtained. Furthermore, the gene expression profiles in the incompatible interaction between L. regale and F. oxysporum were revealed by oligonucleotide microarray analysis of585 unique ESTs comparison to the compatible interaction between a susceptible Lilium Oriental Hybrid 'Siberia' and F. oxysporum. The result of expression profile analysis indicated that the genes encoding pathogenesis-related proteins (PRs), antioxidative stress enzymes, secondary metabolism enzymes, transcription factors, signal transduction proteins as well as a large number of unknown genes were involved in early defense response of L. regale to F. oxysporum infection. Moreover, the following quantitative reverse transcription PCR (QRT-PCR) analysis confirmed reliability of the oligonucleotide microarray data. In the present study, isolation of differentially expressed genes in L. regale during response to F. oxysporum helped to uncover the molecular mechanism associated with the resistance of L. regale against F. oxysporum.
Keywords: Lilium regale Wilson, defense response, Fusarium oxysporum f. sp. Lilii, oligonucleotide microar-ray, suppression subtractive hybridization.
DOI: 10.7868/S0026898414060147
# Статья представлена на английском языке.
* Эл. почта: diqiuliu@126.com
В процессе роста и развития растения часто подвергаются воздействию различных абиотических и биотических факторов стресса, таких как засуха, низкие и высокие температуры, засоленность почвы и присутствие в ней тяжелых металлов, а также вирусов, бактериальных и грибных патогенов. Из биотических факторов наибольший вред причиняют заболевания, вызванные патогенными грибами, которые препятствуют повышению урожайности сельскохозяйственных культур [1]. Лилии (Lilium L.) — одна из важных декоративных культур, однако они часто поражаются различными патогенными грибами, которые повреждают цветы и луковицы. F. oxysporum f. sp. lilii — один из наиболее распространенных и опасных патогенов лилий, вызывает загнивание луковиц, начиная с корней [2]. Следует упомянуть, что широкий спектр хозяев F. оxysporum позволяет считать его модельным организмом, пригодным для изучения вирулентности грибов у растений и млекопитающих [3].
В настоящее время достигнуты определенные успехи в изучении как физиологических, так и биохимических механизмов защиты растений от заражения F. oxysporum. Процесс взаимодействия между Arabidopsis thaliana и F. oxysporum можно разделить на три части: узнавание грибных молекул-активато-ров/патогенассоциированных сигнальных молекул (PAMP) (I), окислительный взрыв (образование активных форм кислорода, АФК) и смерть клеток (II), активация путей передачи сигналов и серия защитных реакций (III) [4]. АФК не только выполняют роль локальных сигнальных молекул, участвующих в гиперчувствительной клеточной гибели, но также служат вторичными посредниками в индукции экспрессии защитных генов [5]. Таким образом, АФК играют центральную роль в защите растений от фи-топатогенов. Изучено также взаимодействие между растениями турецкого гороха (Cicer arietinum l.) и F. oxysporum. Оказалось, что в устойчивых к этому патогену сортах три фермента, связанные с окислительным стрессом — аскорбатпероксидаза (APX), глутатионредуктаза (GR) и глутатионпероксидаза (GPX), активировались сильнее или раньше, чем в сортах, подверженных заражению [6].
Более того, важными компонентами взаимодействия между растениями и F. oxysporum являются пути передачи сигнала и защитные реакции. Сигнальные пути, в которых участвуют абсцизовая (ABA), салициловая (SA) и жасмоновая кислоты (JA), этилен (ET) и ауксин, вовлечены в сложные системы защитных реакций [7]. После активации сигнальных путей повышается экспрессия большого числа генов, связанных с защитой от патогенных организмов, например, генов R и генов, вовлеченных в приобретенный системный защитный механизм (SAR). Гены R прямо или косвенно узнают грибные элиситоры, а затем запускают серию защитных реакций. Недавно в растениях перца (Capsicum annuum) обнаружили большое число
R-генов, узнающих активаторы F. oxysporum. Уровень экспрессии нескольких генов, кодирующих связанный с патогенезом белок 1 (PR1), Р-1,3-глю-каназу (PR2), и хитиназу (PR3), был повышен в листьях, стеблях и корнях растений перца, иноку-лированных F. oxysporum [8]. Повышенная экспрессия гена PR10 корейского женьшеня (Panax ginseng C.A. Meyer) в растениях Arabidopsis усиливала их устойчивость к F. oxysporum [9], конститутивная экспрессия гена тауматин-подобного белка (PR5) риса в растениях банана (Musa sapientum cv. Nangka) также увеличивала резистентность к F. oxysporum f. sp. cubensec [10].
Резистентность к патогенным организмам играет важную роль в программах скрещивания растений с целью выведения сортов, устойчивых к F. oxysporum. Ни один вид дикорастущих или культурных лилий (Lilium) не обладает абсолютным иммунитетом к F. oxysporum, но некоторые виды достаточно устойчивы к этому возбудителю, например, некоторые азиатские гибриды и L. regale Wilson [2]. L. regale — дикорастущий вид, произрастающий в Китае в долине реки Мин. L. regale отличается очень высокой устойчивостью к вирусным и грибным патогенам, а также к такому фактору стресса, как засуха. Этот вид широко используется в селекции лилий, с его участием выведены различные сорта лилий. Однако молекулярный механизм устойчивости L. regale к F. oxysporum остается неясным. В нашей работе с целью обогащения набора генов, ассоциированных с резистентностью L. regale к F. oxysporum, из клеток корня L. regale, инокулированного F. oxysporum, получена библиотека кДНК и проведена ее су-прессионная вычитающая гибридизация (SSH). Затем при помощи анализа EST из обогащенной библиотеки кДНК на олигонуклеотидных микроматрицах определили профили дифференциальной экспрессии генов L. regale и лилии 'Siberia' (чувствительный к патогену восточный гибрид), инокулированных F. oxysporum. Проведенный нами поиск и анализ экспрессии генов L. regale, связанных с устойчивостью, помог прояснить молекулярный механизм, обеспечивающий резистентность этой лилии к F. oxysporum.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Растительный материал и инокуляция патогеном.
Патогенный гриб был выделен в нашей лаборатории из лилий сорта 'Siberia', пораженных фузари-озным увяданием. Межгенные спейсеры рДНК длиной 510 п.н. были высокогомологичны (99% идентичности) ДНК нескольких штаммов F. oxysporum f. sp. lilii, выделенных из L. longiflorum. Кроме того, конидии выделенного гриба были сходны с конидиями F. oxysporum, что дало основание идентифицировать его как F. oxysporum f. sp. lilii. После инкубации на чашке с картофельным агаром с декстрозой (PDA) в течение 1 нед при 28°C,
споры F. oxysporum f. sp. lilii смывали стерильной дистиллированной водой и доводили их концентрацию до 106 спор/мл также стерильной дистиллированной водой. Стерильные луковицы L. regale вместе с молодыми корнями инфицировали спорами F. oxysporum, погружая их в среду со спорами на 15 мин. Параллельно проводили обработку корней стерильной дистиллированной водой, т.е. пустую (контрольную) инокуляцию. Корни луковиц L. regale собирали через 2, 4, 8,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.