ОНТОГЕНЕЗ, 2010, том 41, № 3, с. 190-198
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЭМБРИОЛОГИЯ
УДК 611.013.9
ИЗМЕНЕНИЯ ТОПОЛОГИИ И ГЕОМЕТРИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ЭПИТЕЛИЕВ ШПОРЦЕВОЙ ЛЯГУШКИ ПРИ РЕЛАКСАЦИИ МЕХАНИЧЕСКИХ НАТЯЖЕНИЙ1 © 2010 г. А. Ю. Евстифеева, С. В. Кремнёв, Л. В. Белоусов
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова 119992 Москва, ГСП-2, Ленинские горы E-mail: morphogenesis@yandex.ru Поступила в редакцию 09.12.09 г. Окончательный вариант получен 24.12.09 г.
Статистически оценивали изменения связности клеточных вершин, вершинные углы и апикальные индексы клеток вентральной эпиэктодермы гаструл шпорцевой лягушки в течение первых 4 ч после релаксации механических натяжений. Если в нерелаксированном эпителии подавляющее большинство клеток имеет вершины связности 3, вершинные углы, близкие к 120°, и апикальные индексы порядка 1 (изодиаметрические клетки), то после релаксации число клеток со связностью более 3, число вершинных углов, существенно отклоняющихся от 120°, и процент столбчатых клеток с высоким апикальным индексом возрастают. Вершины связности выше 3 имеют тенденцию собираться в сомкнутые группы, образуя гладкие линии клеточных стенок. Длина и кривизна стенок клеток с вершинами связности 4 достоверно превышает те же показатели в клетках с вершинами связности 3. Отмеченные изменения топологии и геометрии клеток соответствуют перестройкам, наблюдаемым в нормальном морфогенезе. Они рассматриваются в терминах модели гипервосстановления механических натяжений в релаксированных эпителиальных пластах.
Ключевые слова: эпителий, гаструла, Xenopus, вершинные углы, степень вершины, апикальный индекс, топология, геометрия, морфогенез, механическое напряжение.
Значение топологических перестроек клеточных сетей (изменения связности клеточных вершин и контактов "клетка-клетка") для морфогенеза и клеточных дифференцировок отмечали некоторые авторы при изучении разных объектов (Исаева, Прес-нов, 1990; Савостьянов, 2005; Arnolds et al., 1983). С другой стороны, за последнее время получено много данных о регуляции морфогенетических процессов механическими напряжениями эмбриональной ткани или подстилающего ее субстрата (Brouzes, Farge, 2004; McBeath et al., 2004; Engler et al., 2006; Dumais, 2007; Beloussov, 2008; Ramasubramanian, Taber, 2008; Wozniak, Chen, 2009). В нашей работе предпринята попытка объединить два эти подхода и исследовать влияние релаксации механических напряжений на топологическую структуру клеточной сети. Работа выполнена на одной из широко используемых в биологии развития экспериментальных моделей — двойном эксплантате (сэндвиче) вентральной эктодермы гаструлы шпорцевой лягушки Xenopus laevis, который релаксировал после вырезания из целого зародыша. Наружные слои эктодермы (эпиэктодер-
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект № 05-04-48681).
ма) интактного зародыша представляют собой плотный эпителий, который можно рассматривать как плоскую решетку (клеточную сеть), сложенную в основном из гексагональных клеток. Относительная простота и однородность строения такой клеточной сети делают возможным оценивать ее состояние количественно, используя следующие показатели:
1) связность клеточных вершин (число клеточных стенок, выходящих из данной вершины);
2) величины углов при вершинах клеток;
3) количество смежных вершин со связностью >3, лежащих на одной сглаженной линии из клеточных стенок;
4) среднюю длину и кривизну стенок в клетках с вершинами разной связности;
5) средние величины апикальных индексов (Л1) клеток эпиэктодермы (отношение высоты клетки к ширине ее апикальной зоны).
Измерения показали, что уже через несколько минут после релаксации натяжений начинаются активные планарные сокращения отдельных клеточных стенок и целых апикальных поверхностей клеток, что проявляется в возрастании доли вершин со
связностью >3 и, несколько позже, в существенном возрастании значений AI. Клетки с высокими значениями AI (колбовидные) затем утрачивают контакты с соседями и погружаются внутрь клеточного пласта. Этот процесс является примером одного из видов клеточной дифференцировки — эпителиаль-но-мезенхимной трансформации. Кроме того, вершины высокой связности проявляют тенденцию собираться в сомкнутые группы, образуя сглаженные линии клеточных стенок, что имитирует процесс де-ламинации. Таким образом, поведение механически релаксированного клеточного пласта можно рассматривать как упрощенную модель клеточной диф-ференцировки и некоторых морфогенетических процессов. Наблюдаемые явления обсуждаются в терминах модели гипервосстановления механических напряжений (Beloussov, 2008). Согласно этой модели, клеточные структуры, подвергнутые растяжению или, наоборот, релаксации/сжатию внешними силами, должны активно и, как правило, с "перехлестом" восстанавливать предшествующие значения механических напряжений. Применительно к клеточным стенкам эта реакция должна состоять в стимуляции экзоцитозного встраивания субъединиц клеточной мембраны при ее растяжении и, напротив, эндоцитозном поглощении субъединиц при релаксации/сжатии. Такие реакции действительно описаны на ряде объектов (Raucher, Sheetz, 1999; Truschel et al., 2002).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Получение и инкубация эксплантатов. Участки вентральной эктодермы (крыши бластоцеля) зародышей X. laevis стадии 10-10.5 (Nieuwkoop, Faber, 1956) вырезали и сращивали попарно, внутренними сторонами друг к другу. Полученные образцы (эксплантаты) помещали в чашки Петри с агаровым покрытием и инкубировали от 5, 15, 30, 60, 120 и 240 мин в среде 1 x MMR при комнатной температуре 24—27°С, прикалывая образцы иглами к агару без растяжения. Затем эксплантаты фиксировали для проведения конфокальной микроскопии и гистологической обработки с последующей морфометрией. Фиксировали также интактные зародыши соответствующих стадий развития.
Конфокальная микроскопия. Образцы фиксировали в растворе 3.7%-ного формальдегида и 0.25%-но-го глутаральдегида, приготовленном на фосфатном буфере (PBS), промывали в PBS и помещали в буфер PBS-T (0.5%-ный Тритон X-100 на 1 х PBS). Окрашивание проводили смесью фаллоидина и TRITC (0.005 мг/мл в PBS-T) в темноте в течение 45 мин, после чего образцы отмывали в течение 2 ч в буфере
PBS в темноте и помещали в заливочную среду (80%-ный глицерин на PBS).
Получение и обработка изображений поверхностей. Внешние поверхности эксплантатов, не соприкасавшиеся с агаром, и поверхности интактных зародышей фотографировали. Чтобы получить более четкие клеточные границы, фотографии преобразовывали в негативные черно-белые изображения в программе Paint.Net и затем обводили контуром по 60 клеток. У обведенных клеток измеряли углы при вершинах с помощью специально написанной в среде Delphi программы. Кроме того, подсчитывали долю вершин разной связности и долю вершин связности >3, собранных в смежные группы по 2 и более вершин в каждой. Для каждого срока обработали по 500-1500 клеток.
Средние длины и кривизну стенок клеток с вершинами связности 3 и 4 измеряли на выборках, состоящих не менее чем из 100 клеток, изображений интактных зародышей и 5-минутных эксплантатов с помощью программы ImageJ. Кривизну стенок определяли как отношение их реальных длин к длине хорд, соединяющих концы данных стенок.
Сканирующая электронная микроскопия, изготовление полутонких срезов и подсчет апикальнъх индексов. Образцы фиксировали в 2.5%-ном глютаральде-гиде на 0.2%-ном какодилатном буфере, обрабатывали 0.5% OsO4 и заливали в эпон 812. Для сканирующей электронной микроскопии изготовляли поперечные сколы образцов, для оптической микроскопии - полутонкие поперечные срезы, окрашенные 1%-ным толуидиловым синим. На 50100 клетках каждого срока, выбранных на поперечных срезах случайным образом, с помощью программы ImageJ измеряли длины апикальных поверхностей клеток иAI:: отношения наибольшей высоты данной клетки к ее апикальной длине.
Статистическую обработку даннъх проводили в программе STATISTICA 6.0, раздел Basic Statistics. Данные считали достоверными, если они удовлетворяли критериям Стьюдента и Вилкоксона.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Динамика связности клеточнъх вершин. На эксплантатах разных сроков, а также у интактного зародыша стадии 10-10.5 были подсчитаны доли вершин разной связности. Хотя у всех образцов преобладала доля вершин связности 3, уже через 5 мин после вырезания эксплантата было отмечено достоверное возрастание доли вершин более высокой связности по сравнению с интактными образцами (рис. 1). В период 2-4 ч наблюдали вторую волну возрастания связности (различия по связности 4 между эксплантатами 2 и 4 ч статистически досто-
20
15
10
Инт 5
30
60
120 240
Рис. 1. Доля вершин связности >3 (по оси ординат, %) в эксплантатах разных сроков (по оси абсцисс, мин после эксплантации) по сравнению с эпиэктодермой интакт-ных зародышей (Инт). (—□—) — вершины связности 4 (указаны средние значения, стандартная ошибка и стандартное отклонение); (- - • - - ), (■■■■■■■■■) — вершины связности 5 и 6 соответственно (указаны только средние значения).
верны). Доли вершин более высокой связности, хотя и были существенно меньше, но подчинялись той же динамике.
Динамика смежных вершин высокой связности и сглаженных клеточных границ. В релаксированных эксплантатах, начиная с 5 мин после изоляции, достоверно увеличивается доля клеточных вершин, связанных в смежные группы по две и более (рис. 2, а). Доля групп, содержащих более чем две
смежные вершины, начинает возрастать лишь через 30 мин после изоляции, когда увеличение числа групп по две вершины замедляется (ср. рис. 2, а и б). Это свидетельствует о переходе, по крайней мере в период 30—60 мин после изоляции эксплантата, части двухвершинных групп в группы с большим числом вершин. Как видно на рис. 3, а—г, эти группы соединены сглаженными линиями клеточных стенок.
Длина и кривизна клеточных стенок при вершинах разной связности. Сравнивали показатели при вершинах связности 3 и 4 на интактных зародышах разных сроков инкубации и на 5-минутных эксплантатах. Обнаружено, что во всех случаях средние длины и кривизны стенок
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.