ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 575.224:579.23.236:579.22.5
ИЗМЕНЕНИЯ В ФОРМИРОВАНИИ БИОПЛЕНОК УАНВ1 МУТАНТА БАКТЕРИИ AZOSPIRILLUMВВА£П,Е№Е Sp245,
ЛИШЕННОГО ЖГУТИКОВ
© 2015 г. А. В. Шелудько1, Ю. А. Филипьечева, Е. М. Шумилова, Б. Н. Хлебцов, А. М. Буров, Л. П. Петрова, Е. И. Кацы
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, Саратов
Поступила в редакцию 16.06.2014 г.
Бактерии штамма Л10$рт11ыт Ъгазйетв $р245, обладающие смешанным жгутикованием, способны к формированию биопленок на разнообразных поверхностях. В данной работе у лишенного жгутиков мутанта штамма $р245 с инактивированной хромосомной копией гена/1НБ (/¡кБ1) выявлены изменения в поздних этапах формирования биопленок на гидрофильной поверхности (стекло). Толщина "зрелых" биопленок/1НБ1::От^оп-Кт мутанта £р245.1063 существенно уступает таковой у родительского штамма $р245. Биопленки мутанта £р245.1063 более чувствительны к действию сил гидродинамического сдвига. Латеральные жгутики на клетках Л. Ъгаяйете $р245, существующих в составе биопленок, не обнаружены. Однако в "зрелых" нативных биопленках штамма $р245 с помощью атомно-силовой микроскопии выявлены клетки с полярным жгутиком. Предположительно, сохранение на клетках Л. Ъгаяйете $р245 полярного жгутика (возможно, обездвиженного) способствует стабилизации биопленок.
Ключевые слова: Лzospirillыm Ъга8Иете, биопленки, подвижность, жгутики, инсерционные мутации, ген /1НБ.
DOI: 10.7868/S0026365615010127
Азоспириллы способны стимулировать рост и развитие широкого круга растений, с которыми образуют ассоциации [1]. Подвижность Azospiril-lum brasilense обеспечивается одиночным полярным жгутиком (Fla), синтезируемым и в жидких, и на плотных средах, а также многочисленными латеральными жгутиками (Laf), образование которых индуцируется только при повышенной плотности среды [2, 3]. Полярный жгутик используется азоспириллами не только для движения, но и для адсорбции на поверхности корней растений [4].
Для успешного функционирования растительно-бактериальной ассоциации может иметь значение формирование биопленок азоспирилл на поверхности корня. Бактериальная биопленка является пространственно и метаболически структурированным сообществом микрорганиз-мов, заключенных в матрикс, прикрепленных друг к другу и к поверхности раздела фаз [5—8]. Известно, что свободно плавающие ("планктонные") бактерии, переходя к существованию в составе биопленки, утрачивают зависящую от жгутиков подвижность. В то же время инактивация генов,
1 Автор для корреспонденции (e-mail: shel71@yandex.ru).
отвечающих за подвижность, негативно влияет на формирование микробами биопленок [5—8].
В процессе формирования биопленок бактериями с разной физиологией и характером взаимодействия с колонизируемым объектом выявлены общие этапы: адгезия клеток к поверхности, формирование микроколоний, монослоя и многослойной биопленки. По мере старения и исчерпания источников углерода и энергии, биопленка претерпевает дезинтеграцию (или дисперсию), в результате которой бактерии переходят к планктонному образу жизни и поиску новых местообитаний [5—9]. Как оказалось, разнообразие регуля-торных механизмов формирования и структурных элементов биопленок сопоставимо с количеством видов и даже штаммов бактерий, эти биопленки образующих. Иными словами, "сколько бактерий, столько и биопленок" [9].
Формирование биопленок и относительный вклад в этот процесс разнообразных компонентов клеточной поверхности, в том числе жгутиков, у бактерий рода Лzospirillыm очень мало изучены. Показано, что спонтанные или индуцированные изменения состава и (или) структуры плазмид штамма Л. Ъrasilense 8р245, приводящие к дефектам в синтезе липополисахаридов (ЛПС) и экс-
траклеточных полисахаридов, связывающих прижизненный краситель калькофлуор, оказывают заметное влияние на эффективность формирования биопленок азоспирилл на абиотических поверхностях [10, 11]. Инактивация у A. brasilense Sp245 плазмидных генов, кодирующих гипотетические TAD пили, приводит к подавлению образования биопленок [12].
Целью данной работы явилось сравнительное исследование процесса формирования биопленок культурами штамма A. brasilense Sp245 и его инсерционного flhBl мутанта, утратившего способность к синтезу полярного и латеральных жгутиков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальные штаммы. В работе использовали штамм A. brasilense Sp245, выделенный из корней пшеницы [13], и его инсерционный flhBl::Omegon-Km мутант Sp245.1063 с Fla- Laf-фенотипом (KmR) [14]. Этот мутант содержит одиночную вставку искусственного транспозона, Omegon-Km, в хромосомной копии гена flhB (flhBl), кодирующего компонент аппарата экспорта флагеллярных белков. Несмотря на наличие у штамма Sp245 второй копии генаflhB в плаз-мидном кластере генов, по-видимому, определяющем образование Laf [12], flhBl::Omegon-Km мутант Sp245.1063 полностью утратил способность к синтезу и Fla, и Laf [14]. Возможно, в индукции синтеза Laf участвует гипотетическая муль-тисенсорная гибридная гистидинкиназа/регулятор ответа, кодируемая геном AZOBR_150176, транскрибируемым в том же направлении, что и flhBl, и прилегающим к его З'-концу. Вставка омегона в ген flhBl могла оказать негативное влияние и на экспрессию гена AZOBR_150176 в клетках мутанта Sp245.1063 вследствие полярного эффекта [14].
Среды для культивирования бактерий. Культуры A. brasilense выращивали на малатно-солевой среде (MSM) [15] или среде LB [16] при 30°С. При необходимости в среды добавляли канамицин (Km) до 50 мкг/мл и калькофлуор ("Sigma, США") до 1 мг/мл.
Определение скорости роста бактерий в условиях аэрации. Ночные (18 ч) культуры бактерий разводили до значений А590 = 0.05-0.10 (l = 0.5 см) в 100 мл стерильной среды MSM или LB, разлитой в конические колбы объемом 250 мл. Для создания условий интенсивной аэрации колбы помещали на горизонтальную платформу шейкера-инкубатора Excella E24 ("New Brunswick Scientific", США) и инкубировали при 140 об/мин и температуре 30°С. Каждые 2 ч cпектрофотометриче-ски измеряли оптическую плотность бактериальной культуры при А590 (l = 0.5 см).
Определение относительной гидрофобности бактериальных клеток. Для этой цели использова-
ли метод высаливания [17]. В лунки полистироль-ного планшета вносили по 25 мкл серийных разведений раствора сульфата аммония в 2 мМ фосфатном буфере (ФБ; pH 6.8) и по 25 мкл суспензий бактерий в ФБ (A590 = 1.2), приготовленных из 18-часовых погруженных культур в LB, после отмывки клеток буфером. Определяли минимальную концентрацию сульфата аммония, при которой наблюдалась агрегация бактерий. Чем более низкая концентрация соли вызывает агрегацию, тем более гидрофобны клетки [17].
Оценка роста планктонных культур и накопления биомассы в биопленках. Условия, оптимальные для формирования биопленок бактерий А. brasilense Sp245, были подобраны нами ранее [10]. Ночные (18 ч) культуры бактерий разводили стерильной средой LB до значений А590 = 0.05—0.10 (l = 0.5 см), вносили по 2 мл суспензии в стеклянные пробирки емкостью 5 мл или по 4 мл в чашки Петри диаметром 30 мм, на дне которых находились стерильные покровные стекла размером 24 х 24 мм, и инкубировали при 30°С статически. В другой серии экспериментов пробирки с суспензиями бактерий инкубировали при покачивании со скоростью 140 об/мин.
Перед окрашиванием биопленок из пробирок отбирали культуру планктонных бактерий, которую использовали для определения оптической плотности (А590; l = 0.5 см) жидких культур, окружающих биопленки. В пробирки осторожно добавляли 2 мл 1% водного раствора красителя кристаллического фиолетового, инкубировали при комнатной температуре 10 мин, удаляли раствор и осторожно промывали пробирки водой. Для оценки биомассы бактерий связавшийся с биопленками краситель растворяли в 2.5 мл этанола и измеряли оптическую плотность раствора при А590 (l = 0.5 см).
Покровные стекла с биопленками после удаления планктонной культуры использовали для микроскопии.
Фазово-контрастная микроскопия биопленок.
Для световой фазово-контрастной микроскопии использовали прибор Leica LMD 7000 ("Leica", Германия). Перед микроскопией покровные стекла переворачивали биопленкой вниз и помещали на предметное стекло с лункой. Для измерения толщины (высоты) биопленок сначала фокусировали микроскоп на "нижней поверхности" биопленки у стекла. Фиксировали фокусное расстояние в мкм (Z1). Затем определяли фокусное расстояние до "верхней поверхности" пленки (Z2). Толщину пленок определяли по формуле Z= = (Z2 — Z1) х (n/n1), где n — показатель преломления стекла (1.5), а n1 — показатель преломления воздуха (1.0).
Атомно-силовая микроскопия биопленок. При
подготовке препаратов для атомно-силовой мик-
роскопии (АСМ) бактериальные клетки, сформировавшие биопленку на покровном стекле, промывали 50 мМ фосфатным буфером (ФБ, рН 7.0), обезвоживали 75% этанолом в течение 10 мин и высушивали на воздухе. Топографию поверхности биопленок исследовали с помощью атомно-силового микроскопа SolverBio ("НТ-МДТ", Россия), максимальный размер сканируемой области составлял 60 х 60 мкм. Измерения проводили в полуконтактном режиме сканирования поверхности с использованием кремниевых канте-ливеров NSG 10 ("НТ-МДТ", Россия) с модулем упругости 11.8 Н/м и средним радиусом кривизны острия 10 нМ. Размер областей сканирования в мкм представлен на рис. 4, дискретность сканирования составляла 1024 х 1024 точки, частота сканирования — 1 Гц. Сканирование проводили при комнатной температуре на воздухе. Для повышения контрастности и исключения влияния наклона поверхности объекта относительно зонда, полученные изображения обрабатывали с помощью программного комплекса NOVA ("НТ-МДТ", Россия).
Просвечивающая электронная микроскопия биопленок и бактерий из жидких культур. Перед просвечивающей электронной микроскопией биопленок, сформированных на поверхности пробирок или покровных стекол, удаляли культуру планктонных бактерий и дважды осторожно промывали биопленки ФБ (pH 7.0). После этого биопленки смывали аспирацией и суспендировали в ФБ (pH 7.0). Полученные смывы биопле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.