БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2014, том 31, № 5, с. 331-335
УДК 577.352
ИЗОПРЕНОИДНЫЕ ЦЕПИ ЛИПИДОВ ПОВЫШАЮТ УСТОЙЧИВОСТЬ МЕМБРАН К ФОРМИРОВАНИЮ СКВОЗНЫХ ПОР
© 2014 г. П. В. Панов1,2, С. А. Акимов1,3, О. В. Батищев1,2*
Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, 119071, Москва, Ленинский проспект, 31, стр. 5; *электронная почта: olegbati@elchem.ac.ru 2Московский физико-технический институт (государственный университет),
141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., 9 3Национальный исследовательский технологический университет "МИСиС", 119049, Москва, Ленинский просп., 4 Поступила в редакцию 07.04.2014 г.
Исследован процесс электропорации бислойных липидных мембран из дифитаноилфосфатидилхо-лина (ДФФХ) — липида, в котором полярная часть, характерная для липидов эукариотических клеток, сочетается с разветвленными изопреноидными цепями, формирующими гидрофобные "хвосты" липидов архей. Из экспериментальной зависимости среднего времени жизни мембраны от величины приложенной разности потенциалов оценены линейное натяжение кромки поры в липидных бислоях из дифитаноилфосфатитидилхолина, а также коэффициент диффузии пор в пространстве радиусов. Они составили 5.5 ± 0.2 пН и (6 ± 2) х 10-19 м2/с соответственно. Сравнение этих величин со значениями, характерными для липидов эукариотических клеток, говорит о том, что критический радиус пор, приводящих к необратимому электрическому пробою липидного бис-лоя из ДФФХ, меньше, чем у мембран из обычных фосфатидилхолинов, но при этом меньше и вероятность возникновения и роста радиуса проводящего дефекта. По-видимому, эти эффекты могут объясняться высокой гидрофобностью разветвленных изопреноидных цепей данного липида.
Ключевые слова: липидная мембрана, электропорация, археи, линейное натяжение кромки поры. БОТ: 10.7868/80233475514050077
Липидные мембраны архей обладают рядом уникальных свойств, разительно отличающих эти мембраны от мембран бактерий и эукариот и позволяющих представителям этого царства выживать в таких экстремальных условиях, как высокие температуры, повышенная кислотность и давление. Мембрана архей при экстремальных условиях не только не разрушается, но продолжает выполнять важные для клетки функции: служит матрицей для интегральных белков, регулирует перенос ионов и воды внутрь археи и т.п. Уникальные свойства этих мембран обусловлены структурными особенностями их липидов. На сегодняшний день данные о липидном составе ар-хей, выращенных в разных условиях, о влиянии тех или иных особенностей структуры липидов архей на свойства мембран, и о самих свойствах этих мембран являются фрагментарными и недостаточными для понимания их функционирования. Археи, в основном, содержат диэфирные и тетраэфирные липиды [1—3], нетипичные для представителей других царств, и являющиеся одним из таксономических признаков архей. По-видимому, химически более устойчивая простая
эфирная связь помогает археям существовать при высоких температурах, а также в сильнокислых и сильнощелочных средах [4]. Липидные "хвосты" архей представляют собой полностью насыщенные (за редким исключением) изопреноидные цепи, иногда содержащие циклопропановые и/или циклогексановые кольца, что также нетипично для бактерий и эукариот, липиды которых, как правило, представляют собой неразветвлен-ные остатки жирных кислот. Такая структура гидрофобной части молекулы не только помогает ар-хеям существовать при повышенных температурах, но и предохраняет их мембраны от пагубного воздействия различных фосфолипаз, выделяемых другими микроорганизмами, а также от окислительного стресса [5]. Однако вопрос о роли разветвленной структуры цепей в проницаемости мембран архей для различных ионов, газов и воды по-прежнему остается открытым [2].
Одна из основных функций биологических мембран — барьерная функция, заключающаяся в отделении клетки и ее органелл от окружающей среды и определяющая устойчивость клетки к внешним воздействиям. Очевидно, что образова-
332
ПАНОВ и др.
ние в мембране проводящих дефектов — пор — нарушает эту функцию. Это, с одной стороны, может привести к гибели клетки, так как она теряет возможность к поддержанию осмотического градиента по разные стороны от своей плазматической мембраны, с другой, находит применение в различных биомедицинских и биотехнологических приложениях, таких как электротрансфек-ция [6], электрослияние клеток [7], адресная доставка лекарств [8], введение в клетку различных белков [9] и т.п. Таким образом, устойчивость мембраны к образованию сквозных гидрофильных пор является одной из важных характеристик липидного бислоя. Поэтому разумно предположить, что особенности строения гидрофобных цепей липидов архей будут влиять на процесс формирования пор в мембране из таких липидов, как было отмечено в ряде работ [10—13]. Один из способов создания в мембране подобных проводящих дефектов — электропорация —экспериментально изученное для различных модельных и клеточных систем явление [14—18], теория которого была разработана Ю.А. Чизмаджевым и со-авт. [19, 20]. Наиболее подробно исследован электрический пробой бислойных липидных мембран (БЛМ) [19], давно используемых в качестве удобной экспериментальной системы, моделирующей липидный матрикс клеточных мембран.
В данной работе мы исследовали устойчивость к воздействию электрического поля БЛМ, сформированных из раствора дифитаноилфосфатидилхо-лина (ДФФХ) — липида, в котором полярная часть, характерная для липидов эукариотических клеток, сочетается с разветвленными изопреноидными цепями, формирующими гидрофобные "хвосты" липидов архей. Известно, что такие липиды имеют высокую термостабильность, т.е. они не имеют фазового перехода в состояние геля в диапазоне температур от —80 до +120°C [21], однако вопрос о влиянии структуры их гидрофобной части на устойчивость липидного бислоя к образованию сквозных пор и необратимому электрическому пробою не был досконально изучен.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бислойные липидные мембраны формировались по методу Мюллера-Рудина [22] из раствора 1,2-дифитаноил-да-глицеро-3-фосфохолина (ДФФХ, Avanti Polar Lipids, США), в декане (чистота >99.5%, Fluka Chemika, Швейцария) с концентрацией 10 мг/мл на отверстии диаметром 1.2 мм в тефлоновой перегородке, разделяющей две полуячейки. Полуячейки наполняли раствором 100 мМ KCl (чистота >99.5%, Реахим, Россия) и 5 мМ HEPES (чистота >99%, Helicon, Россия) в бидистиллированной воде, доведенным при помощи 1 М KOH до pH 7.0, и в каждую из них погружали Ag/AgCl электрод. Значения pH определялись цифровым рН-метром (Эконикс, модель
Экотест-120, Россия). За процессом создания мембран наблюдали с помощью монитора (TVS, модель ММ-15, Тайвань), изображение на который подавали с микроскопа (МБС-2, Россия) посредством цифровой фотокамеры (Kampro, модель KC-583C, Тайвань).
Электрические наблюдения за процессом формирования мембраны проводили потенцио-динамическим методом [23]. Треугольные импульсы напряжения амплитудой 100 мВ (от пика до пика) и частотой от 10 до 100 Гц (обычно 100 Гц) подавались с генератора электрических сигналов специальной формы (GW Instek, модель GFG-8219A, Китай). Токовые отклики регистрировали с помощью усилителя тока (Keithley, модель 427, США) на осциллографе (Fluke, модель 124, Нидерланды) и выводили на компьютер с помощью карты АЦП (Л-кард, модель L761, Россия). Величины проводимости и емкости мембран рассчитывали по схеме с их параллельным соединением (аналог адмиттанса). Такая схема отвечает структуре липидных мембран, имеющих электрическое сопротивление значительно более высокое, чем раствор электролита в ячейке.
После формирования мембраны к ней прикладывали постоянное напряжение амплитудой от 200 до 400 мВ и регистрировали время ожидания электрического пробоя — резкого падения электрического сопротивления между электродами. Соответствующий этому процессу сигнал записывали на компьютер и по положениям на временной шкале скачка напряжения, соответствующего началу подачи постоянного напряжения, и скачка, соответствующего разрыву мембраны, определяли время жизни мембраны при заданном значении напряжения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изменение свободной энергии липидной мембраны при образовании в ней сквозной поры радиусом r определяется по формуле [19]:
AE = Inry-nr 2ъ-ш 2Суд - 1|—, (1)
Vе м J 2
где а — поверхностное натяжение мембраны, у — линейное натяжение кромки поры, Суд — удельная электрическая емкость мембраны, ев — диэлектрическая проницаемость воды, ем — диэлектрическая проницаемость мембраны, U — величина приложенной к мембране разности потенциалов. Зависимость энергии системы от радиуса поры имеет вид кривой с максимумом, соответствующим критическому радиусу поры, r^. Образование пор с радиусом выше критического ведет к разрыву мембраны. Если радиус ниже критического, то пора постепенно закрывается. Таким образом, мембрана рассматривается как метастабильная система, разрушение которой происходит за счет роста размера дефектов — гидрофильных пор. Для нахождения
ИЗОПРЕНОИДНЫЕ ЦЕПИ ЛИПИДОВ
333
среднего времени жизни мембраны рассмотрим поток дефектов в пространстве радиусов г [24]:
J = -В (дС + , (2)
\дг кТйг!
где Б — коэффициент диффузии дефектов в пространстве радиусов, к — постоянная Больцмана, Т — абсолютная температура, с — концентрация дефектов, являющаяся функцией радиуса дефекта и времени. Если радиусы дефектов находятся в интервале (0; г^), то они могут лишь изменяться без появления или исчезновения дефектов, т.е. можно записать уравнение непрерывности:
дс , дJ
■ + — = 0 дг дг
(3)
т.е. уравнение диффузии для дефекта примет вид:
с й Е
дс = в (дс + .Х- дс дЕ +
-2 кТдг дг кТйг2
(4)
с(г)=Вехр (-Е)!ехр ((Т Ь
(5)
где / — стационарный поток дефектов. Из (1) можно показать, что
У
суд I!:-')т
2
Е(гкр) = ■
лу
ст + С у
е„ _ 1 и
2 '
(6)
(7)
(кТ)
3/2
4пс0АВу.1а + СуД| - 11^-
х ехр
яу
V
кТ|а + Суд|^ - Ж
(8)
0 0.4
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 t, с
дг Удг"
с граничными условиями /(0, 1) = 0, с(гкр, 1) = 0. Для высоких барьеров можно воспользоваться приближением стационарной диффузии [
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.