== РАДИАЦИОННАЯ ГЕНЕТИКА =
УДК [57+61]::539.1.04:611.018.53:575.224.23
ИЗУЧЕНИЕ АБЕРРАНТНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ В ЛЕЙКОЦИТАХ КРОВИ ЛИКВИДАТОРОВ АВАРИИ НА ЧАЭС
© 2014 г. Н. С. Кузьмина*, А. Е. Мязин, Н. Ш. Лаптева, А. В. Рубанович
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва
С помощью метилчувствительной рестриктазы ЛеИ и последующей ПЦР проведено изучение аберрантного гиперметилирования СрО-островков промоторов генов клеточного цикла (р16/СБКМ2Л, р14/АЕ1, ВЛ38¥1Л) и детоксикации (08ТР1) в лейкоцитах 83 ликвидаторов аварии на ЧАЭС (38— 76 лет) и лиц двух контрольных групп (48 чел., возраст < 35 лет, и 65 чел., возраст > 35 лет). Общее количество АсИ-сайтов в исследованных фрагментах составляло от 2 до 7 для разных локусов. Только у 1 человека (2.1 %) из контрольной группы молодых людей (<35 лет) выявлено метилирование изученных СрО-динуклеотидов гена RASSF1A. Как у ликвидаторов аварии на ЧАЭС, так и у лиц од-новозрастной контрольной группы (>35 лет) выявлены случаи аберрантного метилирования промоторов всех генов. Доля лиц с выявленным аберрантным метилированием хотя бы одного гена в группе ликвидаторов составила 28.92% и достоверно превышала (р = 0.016) этот показатель в контрольной группе (12.31%). Выявлена существенно повышенная частота облученных лиц с аномальным метилированием СрО-островка гена 08ТР1 (р = 0.023). С возрастом встречаемость метилирования промотора гена RASSF1A статистически значимо возрастала как в контрольной группе (г = 0.214; р = 0.023), так и у ликвидаторов аварии на ЧАЭС (г = 0.230; р = 0.036). В отношении остальных генов подобной тенденции не обнаружено. Множественный регрессионный анализ показал, что рост числа метилированных локусов из совокупности генов р16, р14 и GSTP1 обусловлен исключительно фактом экспонирования (OR = 7.32, 95%-ный ДИ = 2.49—25.83, р-уа1ие = 2.7 х 10-5). Таким образом, впервые показана реальность радиационно-индуцированного аберрантного метилирования СрО-островков промоторов генов, участвующих в основных защитных функциях клетки, в организме человека в отдаленный период после облучения.
Аберрантное метилирование, CpG-островок, промотор, гены Р16/СБК^2А, P14/ARF, RASSF1A, GSTP1, метилчувствительная ПЦР, лейкоциты крови, ликвидаторы аварии на ЧАЭС.
БОТ: 10.7868/80869803114020064
Интенсивное накопление знаний об эпигенетической регуляции функционирования генома приводит к необходимости изучения новых аспектов генотоксического действия мутагенов на организм человека, в том числе и радиации [1, 2]. Как известно, эпигенетические изменения не связаны с нарушениями в последовательности ДНК, но играют большую роль в стабильности и регуляции генома. Метилирование ДНК — ключевая эпигенетическая модификация, связанная с ковалентным присоединением метильной группы от S-аденозил-Ь-метионина к пятому углероду цитозинового кольца с образованием 5-метил-цитозина, в значительной степени подвержена влиянию экзогенных и эндогенных факторов [2, 3].
Большинство метилированных цитозинов локализовано в транспозонах, представляющих со-
* Адресат для корреспонденции: 119991 Москва, ФГБУН ИОГен им. Н.И. Вавилова РАН; тел.: (499) 132-6627; e-mail: nin-kuzmin@yandex.ru.
бой повторяющиеся последовательности ДНК и составляющие более 40% генома человека. Неме-тилированные СрО динуклеотиды представлены, в основном, в СрО-островках — специфичных районах ДНК, характеризующихся содержанием О + С не ниже 0.5, и отношением наблюдаемого СрО состава к ожидаемому не ниже 0.6, в пределах последовательности не короче 200 пар нук-леотидов (п.н.). СрО- островки могут быть как ассоциированы с промоторами многих генов, так и удалены от сайтов старта транскрипции. В гаплоидном геноме человека насчитывается 25495 не-метилированных СрО-островков, тогда как общее их количество превышает 350000 [2].
К изменениям паттерна метилирования относятся тотальное гипометилирование генома, ло-кус-специфическое гипер-/гипометилирование и потеря импринтинга. Реальность этих эпигенетических нарушений, индуцированных радиацией, показана в экспериментах с использованием методик клонирования клеток, а также лабораторных животных [4—11]. Большая часть исследо-
ваний посвящена оценке тотального метилирования генома по уровню метилированных цитозинов LINE-1 и Alu повторов. Результаты свидетельствуют о превалировании эффектов ги-пометилирования, хотя встречается и гиперметилирование. Один из основных механизмов инактивации генов — аномальное метилирование цитозинов, расположенных в CpG-островках, ассоциированных с активно работающими промоторами. В частности, гиперметилирование CpG-островков генов-супрессоров опухолевого роста и ряда других генов, вовлеченных в канцерогенез, приводит к их инактивации и выявляется в клетках различных злокачественных новообразований [12—14 и др.]. В то же время в радиобиологической работе [11] предпринято изучение и показано аномальное метилирование промотора гена опухолевого супрессораp16(INKa) в клетках печени при хроническом воздействии (50 сГр) у облученных мышей-самцов. Хотя считается, что изменения в степени метилирования потенциально обратимы, эти эпигенетические нарушения часто сохраняются длительное время и могут наследоваться [3, 15].
В связи с вышесказанным, цель данной работы заключалась в изучении аберрантного гиперметилирования CpG-островков промоторов генов клеточного цикла (ß16/CDKN2A, рМ/ARF, RASSF1A) и детоксикации (GSTP1) в лейкоцитах ликвидаторов аварии на ЧАЭС в отдаленные сроки после перенесенного радиационного воздействия.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
В работе использован ранее созданный (2003— 2007 гг.) в лаборатории экологической генетики ИОГен РАН банк ДНК необлученных лиц (113 чел.) двух возрастных контрольных групп: 48 человек (не старше 35 лет) и 65 человек (38— 76 лет), а также облученных ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС (83 чел., 38—76 лет, 79 мужчин и 4 женщины). Большая часть ликвидаторов (67 чел.) проходила обследование и лечение в 2003—2007 гг. в Отделении радиационной медицины ФГУ "РНЦРР Росмедтехнологий". Остальные 16 человек поступили в Федеральный детский центр противорадиационной защиты МНИИ педиатрии и детской хирургии Росздрава с целью обследования своих детей. Зарегистрированные дозы облучения (если такие сведения имелись) находились в диапазоне от 35 до 480 мЗв. Сроки работ в зоне ликвидации составили от 2 нед до 6 мес. Лица контрольной группы в возрасте до 35 лет были практически здоровы.
Спектр мультифакториальной заболеваемости у пациентов контрольной группы старшего возраста (38—76 лет) и ликвидаторов аварии на ЧАЭС был, в основном, представлен распространенными патологиями: функциональные нервные расстройства, болезни сердца и сосудов, обструктив-ные заболевания органов дыхания, эссенциаль-ная гипертензия, хронические гастродуодениты, язвенная болезнью желудка и 12-перстной кишки, остеохондроз, доброкачественные изменения щитовидной железы и др. Хотя спектр заболеваемости в этой контрольной группе и у ликвидаторов аварии на ЧАЭС был одинаков, у облученных людей выявленная патология имела более тяжелое течение и сочетанный характер. Злокачественные новообразования у всех обследованных пациентов отсутствовали. От каждого пациента были получены информированное согласие на исследование и заполненная анкета со сведениями о времени, продолжительности, характере работы в зоне, о перенесенных рентгенодиагности-ческих процедурах, наличии/отсутствии профессиональной вредности.
ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови с помощью наборов Magnet™ DNA MegaPrepl (OOO "Лаборатория Изоген", Россия), руководствуясь прилагаемой инструкцией, наряду с введением некоторых модификаций. Выход ДНК составляет 30—40 мкг из 1 мл крови. Концентрацию выделенной ДНК определяли с помощью флюориметра Qubit® 2.0. Fluorometer и набора реагентов Qubit™ dsDNA HS Assay Kits ("Invitrogen", США) согласно прилагаемым рекомендациям.
Анализ метилирования отдельных CpG-ди-нуклеотидов CpG-островка промоторного района генов р16^ШМ, рМ/ARF, RASSF1A, GSTP1 [16—18] был выполнен с использованием метил-чувствительной полимеразной цепной реакции (МЧ-ПЦР). Метод основан на способности мети-лчувствительных рестриктаз гидролизовать только неметилированные участки узнавания, а участки узнавания, содержащие 5-метилцитозин, остаются нерасщепленными. Наши исследования мы начали с использования рестриктазы AciI (5'...ClC GC...3').
На предварительном этапе были отработаны и оптимизированы условия рестрикции и ПЦР-ам-плификации ДНК по каждому локусу. При отработке экспериментальных условий основное внимание отводилось получению воспроизводимых результатов посредством стандартизации каждого этапа эксперимента.
Реакцию рестрикции проводили с использованием стандартного протокола фирмы "Fermen-
F —
GGATTTCTTTTTAACAGAGTGAACGCACTCAAACACGCCTTTGCTGGCAGGCGGG
GGAGCGCGGCTGGGAGCAGGGA
GGCCGGAGGGCGGTGTGGGGGGCAGGTGGGGAGGAGCCCAGTCCTCCTTCCTTGC CAACGCTGGCTCTGGCGAGGGC
TGCTTCCGGCTGGTGCCCCCGGGGGAGACCCAACCTGGGGCGACTTCAGGGGTGC CACATTCGCTAAGTGCTCGGAG
TTAATAGCACCTCCTCCGAGCACTCGCTCACGGCGTCCCCTTGCCTGGAAAGATA CCGCGGTCCCTCCAGAGGATTT
6А66САСАС6СТСС6А6С6СССТСТТСС(?ССАССАСС6САС6ААСАААСАССАСС СССТС-ССТСС-САССАСАСССТ *
— Я
ССССССбАСССССТССССТСССССССТССССАСАСССССАСАССАСйСАСССССС СССвСССАССАССАТСЗ _ _ ^
Рис. 1. Нуклеотидная последовательность проанализированного участка промотора генар16/СБКК2А. СО-динуклео-тиды подчеркнуты. Два участка узнавания рестриктазы ЛеИ (SsiI) и соответственно проанализированные СрО-пары выделены курсивом и отмечены *. Позиции прямого и обратного (■^R) праймеров подчеркнуты двумя линиями. ЛТО кодон — сайт начала транскрипции. Стрелка---» — направление транскрипции.
*
tas" (Литва), который был нами модифицирован и адаптирован для работы с малыми количествами ДНК. Геномную ДНК (15 нг) обрабатывали 1 ед. акт. фермента AciI в 10xBuffer О в течение 1 ч при 37°С. Общий объем реакционной смеси составлял 20 мкл. На следующем этапе для амплификации брали 3.3 мкл этой смеси, содержащей 2.5 нг гидролизованной ДНК. Такой подход, с одной стороны, позволил создать оптимальные условия для макс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.