научная статья по теме ИЗУЧЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ И МЕМБРАНОТР ОПНОЙ АКТИВНОСТИ ХИНОЗАЛИНОВОГО АЛКАЛОИДА ТРИПТАНТРИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ Биология

Текст научной статьи на тему «ИЗУЧЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ И МЕМБРАНОТР ОПНОЙ АКТИВНОСТИ ХИНОЗАЛИНОВОГО АЛКАЛОИДА ТРИПТАНТРИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ»

= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =

УДК 76.03.31, 616-092.9, 616-03, 616-091.8, 577.125.8, 57.017.3

ИЗУЧЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ И МЕМБРАНОТР ОПНОЙ АКТИВНОСТИ ХИНОЗАЛИНОВОГО АЛКАЛОИДА ТРИПТАНТРИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ

© 2015 г. А.М. Попов* **, А.Н. Осипов***, Е.А. Корепанова***, О.Н. Кривошапко*, Ю.П. Штода*, А.А. Климович*

*Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, 690022, Владивосток, просп. 100-летия Владивостока, 159;

E-mail: ророуат@р1Ьос.йуо.гы **'Дальневосточный федеральный университет, 690000, Владивосток, ул. Октябрьская, 27;

***Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России, 117997, Москва, ул. Островитянова, 1;

E-mail: osipov@fbm.msы.rы Поступила в p едакцию 03.12.14 г.

После доработки 19.01.15 г.

П роведено сравнительное исследование антиоксидантных (радикалперехватывающих) свойств триптантрина (хиназолинового алкалоида, обладающего высокой противовоспалительной активностью и найденного во многих видах различных семейств высших растений и микроорганизмов, включая микробиом человека) в системах 2,2'-азобис(2-метилпропионамидин)дигид-рохлорид-люминол и гемоглобин-пероксид водорода-люминол и оценено его влияние на проницаемость плоских бислойных липидных мембран. В качестве эталонного антиоксиданта был использован тролокс, а в качестве стандартов - а скорбиновая кислота и дигидрокверцетин. Показано, что триптантрин проявляет очень слабую антиоксидантную активность, заметно уступая эталонному и стандартным антиоксидантам в тестах по антиоксидантной активности в обеих исследованных системах. По эффективности антиоксидантного действия исследуемые вещества могут быть выстроены в следующий ряд: дигидрокверцетин > тролокс > аскорбиновая кислота > триптантрин. Антиоксидантный потенциал триптантрина приблизительно в 1000 и 3000 раз меньше, чем у тролокса и у биофлавоноида дигидрокверцетина соответственно. Т риптантрин не вызывает достоверного изменения проницаемости плоских бислойных мембран в диапазоне доз от 0,5 до 10 мкг/мл. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии у триптантрина значимой радикалперехватывающей и мембранотропной активности. Можно предположить, что отмеченная для триптантрина высокая противовоспалительная активность не связана с нейтрализующим действием в отношении активных форм кислорода и влиянием на проницаемость клеточных мембран. Предполагаемые механизмы биологической активности триптантрина обсуждаются.

Ключевые слова: алкалоиды, триптантрин, антиоксиданты, активные формы кислорода, противовоспалительная активность.

Триптантрин - алкалоид хиназолинового ряда (рис. 1а), выделенный из ряда растений, различных микроорганизмов и кожных дрож-жеподобных грибов человека, обладает широ -ким спектром медико-биологической активности [1-4]. В настоящее время отлажены схемы органического синтеза этого соединения [5]. На разных экспериментальных моделях триптан-

Сокращений: АБАП - 2,2'-азобис(2-метилпропионамидин) дигидрохлорид, Н b - гемоглобин, ЛМ - люминол, АОА -антиоксидантная активность.

трин эффективно ингибирует воспалительные процессы, связанные с р азвитием аллергических реакций замедленного типа, являясь сильным, но непрямым природным ингибитором клеточного биосинтеза лейкотриенов - провоспали-тельных медиаторов, которые продуцируются под действием циклооксигеназы-2 и арахидо-нат-5-липоксигеназы. Как мощный противовоспалительный агент, триптантрин значительно ингибирует продукцию макрофагами как N0, так и простагландина Е(2) [6,7]. Однако наиболее эффективно триптантрин подавляет функ-

Pис. 1. Химические структуры исследуемых веществ: (а) - триптантрин, (б) - дигидрокверцетин (в) - тролокс и (г) - аскорбиновая кислота.

циональную активность различных цитокинов: интер лейкинов, факторов роста и у-интер феро -на в опухолевых и иммунокомпетентных клетках, принимающих участие в воспалительных реакциях [8-10].

И спользуя в качестве но сителя т р иптантр и-на хитозан, мы разработали лекарственную фо р му пр епар ата, названного «Коур о хитином», котор ый пр оявляет, пр ежде в сего, пр отивовос-палительную, ранозаживляющую, противоаллергическую и противомикробную активность [1-3]. Модулир ующее действие редокс-активных соединений, которые часто называют антиок-сидантами, на свободнор адикальные пр оцессы часто спо собствует как усилению, так и о слаб-лению сложных процессов, вызывающих воспаление. Поэтому такие антиоксиданты на клеточном уровне могут вызвать нежелательные побочные эффекты, связанные с нейтрализацией функционально значимых для внутриклеточной сигнальной тр ансдукции активных фо р м кислорода [4].

Учитывая отмеченный выше шир окий спектр биологической активности тр иптантр и-на и его фармакологическую перспективность как потенциального противовоспалительного и иммуномодулирующего агента, цель настоящей р аботы со стояла в пр оведении ср авнительного исследования антиоксидантных (радикалперех-ватывающих) свойств тр иптантр ина в системах 2,2'-азобис(2-метилпр опионамидин)дигид р о хлор ид-люминол и гемоглобин-пер оксид водор о -да-люминол в сравнении с тролоксом, аскорбиновой кислотой и дигидр оквер цетином, структурные формулы которых приведены на рис. 1б-г, и оценке его мембранотропной ак-

тивности с использованием плоских бислойных липидных мембран.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В р аботе использовали: тр иптантр ин, 2,2'-азобис(2-метилпр опионамидин)дигидр о хлор ид (АБАП), гемоглобин (НЬ), аскорбиновую кислоту («Sigma-Aldrich», США), люминол (ЛМ), тр олокс («Fluka», Швейцар ия); дигидр оквер цетин (ОАО «Диод», Россия); KH2PO4, KOH, ди-метилсульфоксид («X иммед», Р о ссия).

Антиоксидантные свойства тр иптантр ина изучали с помощью двух хемилюминесцентных модельных систем окисления: гомогенной системы, со стоящей из гемоглобина, пер оксида водо р ода и люминола (Н Ь-Н 2О 2-ЛМ), и гомогенной системы, представляющей собой раствор азосоединения 2,2'-азобис(2-метилпропионами-дин)дигидр о хлор ида и люминола (АБАП -ЛМ) [11].

X емилюминесцентные измер ения пр оводили с помощью хемилюминометра ХЛМ-3 («Би-кап», Ро ссия). Кинетику хемилюминесценции регистрировали и обрабатывали с помощью интер фейса MaoLab/2e (ADInstruments, Австр а -лия), связанного с компьютер ом Madntosh LC II.

На полученных кинетиках опр еделяли длительность латентного периода, которую рассчитывали как время от момента введения АБАП до начала развития свечения. Далее находили значения латентного пер иода в контр о -ле (величина t0) и для различных концентр аций тр олокса, дигидр оквер цетина, а скор биновой кислоты и тр иптантр ина (величина t).

После этого строили калибровочную зависимость латентного периода от концентрации тролокса по следующему линейному уравнению:

t/ t0 = 1 + Кт х Ст,

(1)

где г/г0 - изменение латентного периода; Кт -константа изменения латентного периода для тролокса; Ст - концентрация тролокса.

Затем аналогичную зависимость находили для исследуемого препарата:

t/to = 1 + Kr х Cx,

(2)

где Шо - изменение латентного периода хеми-люминисценции; Кх - константа изменения латентного периода для исследуемого вещества;

C

концентрация исследуемого вещества.

Все исследованные препа раты имели хоро -шую линейную зависимость полученного уравнения (2) (коэффициент линейной корреляции 0,98-0,99). В этом случае можно записать:

Кх х Cx = Кт х Ст.

(3)

И спользуя уравнение (3) и рассчитанные по линейным уравнениям значения констант Кх и Кт, определяли величину антиоксидантной активности (АОА) препарата как отношение концентрации тр олокса к концентр ации исследуемого препарата в модельной системе:

АОА = Ст / Сх = Кх /Кт.

(4)

30 мкМ люминола и определенный объем исследуемого объекта. Инициирование окисления ЛМ о существляли введением 90 мкМ пероксида водорода. Исследуемые вещества добавляли перед введением Н2О2 [11].

Антиоксидантную активность препаратов в системе АБАП-ЛМ также определяли по окислению люминола, инициированному пероксиль-ными радикалами. Среда инкубации объемом 5 мл содержала: 5 мМ АБАП и 10 мкМ люминола в фосфатном буфере (50 мМ КН2РО4, 100 мкМ ЭДТА, рН 7,4). В среду инкубации, содержащую люминол, вводили АБАП и измеряли контрольную хемилюминограмму. Кинетики хемилюминесценции р егистр ир овали в присутствии исследуемых веществ, которые добавляли в среду инкубации перед вводом АБАП [11].

Действие триптантрина на электрическую проводимость плоских фосфолипидных мембран оценивали, как описано ранее [11]. Все исследуемые вещества растворяли в диметил-сульфоксиде. Для их формирования использовали раствор азолектина в декане (25-30 мг/мл). Стандартное измерительное напряжение равнялось 50 мВ. Величину электр опроводности рассчитывали по формуле:

r U - U х 1 гг 1 = х R- [С м1

(5)

Чем больше величина антиоксидантной активности у исследуемого препарата, тем эффективнее он перехватывает радикалы-инициаторы в данной модельной системе.

В данных исследованиях тролокс был использован в качестве эталонного антиоксиданта (рис. 1б), а аскорбиновая кислота и дигидро-кверцетин соответственно взяты в качестве известных стандартных антиоксидантов (рис. 1в,г).

Триптантрин растворяли в фосфатном буфере в концентрации 0,01 мг/мл. Тролокс и дигидроквер цетин сначала растворяли в этаноле в концентрации 10 мМ, затем полученный раствор разводили фосфатным буфером до концентрации 100 мкМ и использовали в работе. Все раствор ы готовили непоср едственно пер ед экспериментом.

Для измерения хемилюминесценции, сопро -вождающей окисление люминола в системе Н Ь-Н2О2-ЛМ, в кювету хемилюминометра последовательно добавляли фосфатный буфер (50 мМ КН2Р04, 100 мкМ ЭДТА, рН 7,4) до конечного объема 5 мл, 0,3 мкМ гемоглобина,

где Ом - электропроводность мембраны; U -напряжение, подаваемое от потенциометра; U' -напряжение на выходе; R эт - эталонное сопро -тивление. П ри построении гр афиков использовали значение удельной электропроводности GJSм, [Ом-1-см-2 = Cм-см-2], где Ом - интегральная проводимость мембраны, Sм - площадь мембраны.

Для математической обработки экспер имен-тального материала мы

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком