ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ СЕМЕЙСТВА КАТЕЛИЦИДИНОВ
Юхнев В. А.1, Шамова О. В.12
'ФГБУ «НИИ Экспериментальной медицины» СЗО РАМН; 2Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
Кателицидины составляют группу катионных пептидов, содержащихся в клетках системы врожденного иммунитета. Эти пептиды играют важную роль в обеспечении противо-инфекционной защиты организма, а также рассматриваются как прототипы лекарственных препаратов нового поколения. Нами проведен сравнительный анализ биологической активности структурно-различных кателицидинов: пептидов с конформацией альфа-спирали, бета-шпильки, обогащенных пролином кателицидинов. Изучено влияние ряда факторов (концентрации хлорида натрия в среде, присутствия сыворотки крови) на активность пептидов в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий, исследовано действие пептидов на мембрану бактерий, а также их токсичность в отношении культивируемых клеток млекопитающих. Показано, что наиболее перспективными свойствами для практического применения обладает обогащенный пролином пептид ChBac5 лейкоцитов козы, который сочетает высокую антимикробную активность в отношении антибиотикоусойчивых штаммов бактерий и низкую токсичность для клеток человека.
Ключевые слова: врожденный иммунитет, антибактериальные пептиды, кателицидины
Введение. Проблема поиска новых антибиотических лекарственных средств в настоящее время является важнейшей задачей биомедицины, так как резистентность патогенных микроорганизмов к применяемым в медицине антибиотикам стремительно растет. Антимикробные пептиды (АМП) из семейства кателицидинов являются важнейшими защитными соединениями системы врожденного иммунитета, обеспечивающими быстрое противодействие инфекционным агентам. Природные антимикробные молекулы животного происхождения рассматриваются многими учеными, как перспективные прототипы принципиально новых противо-инфекционных средств. Изучение механизма антимикробного действия АМП, а также других видов их биологической активности, является актуальным направлением в области иммунологии, микробиологии и медицинской химии, так как предоставляет важную информацию для понимания фундаментальных механизмов функционирования системы врожденного иммунитета, а также дает основу для структурно-функционального анализа
аналогов АМП, направленного на создание новых антибиотиков. Семейство кателици-динов включает пептиды разной структуры, объединенные в одну группу благодаря наличию сходных кателиноподобных доменов в их молекулах-предшественниках. Целью данной работы явилось сравнительное изучение биологической активности структурно различных пептидов семейства кателициди-нов. В задачи исследования входила оценка антибактериальной активности пептидов в отношении грамотрицательных и грампо-ложительных бактерий, включая антибиоти-коустойчивые штаммы; изучение факторов, влияющих на антимикробную активность; оценка липополисахарид-связывающей активности пептидов; их способности влиять на барьерную функцию цитоплазматичекой мембраны бактерий; а также изучение токсичности АМП в отношении клеток человека. Объектами исследования явились кателици-дины, молекулы которых имеют разные кон-формации: кателицидин человека КЬ-37 [1] (конформация альфа-спирали), протегрин 1 нейтрофилов свиньи [2] (конформация бета-
шпильки), линейные обогащенные пролином бактенецины нейтрофилов козы - ChBac5 [3] и ChBac3.4 [4].
Материал и методы. Антимикробную активность АМП исследовали с помощью метода радиальной диффузии в агарозном геле, а также стандартного метода оценки действия антибиотиков в жидкой питательной среде. Метод радиальной диффузии пептидов в ага-розных гелях, содержащих микроорганизмы, использовали, как описано [5]. Пептиды в серийных разведениях вносили в лунки ага-розных гелей (1% агароза, Sigma, США), приготовленных на 0.01 М натрий-фосфатном буфере (НФБ), рН 7.4 без добавления хлорида натрия или, в ряде экспериментов с 150 мМ NaCl, и содержащих исследуемые микроорганизмы. Штаммы бактерий предоставлены сотрудниками Калифорнийского университета Лос-Анджелеса (США), университета г. Триеста (Италия), Отдела генетики микроорганизмов ФГБУ НИИЭМ СЗО РАМН, ФГБУ РНИИ Травматологии и ортопедии им. Р. Р. Вредена, ВМА им. С. М. Кирова МО РФ. Оценку антимикробной активности методом серийных разведений пептидов в жидкой питательной среде проводили по стандартной методике с небольшими модификациями [6]. В качестве питательной среды для бактерий использовали бульон Мюллера-Хинтон, разведенный в два раза НФБ с 150 мМ NaCl. В ряде экспериментов эта среда содержала 10% инактивиро-ванную сыворотку крови коров. Оценку изменения проницаемости мембран E.coli ML35p для хромогенных маркеров под действием пептидов осуществляли, как описано в работе [7]. О состоянии цитоплазматической мембран E.coli ML35p судили по ее проницаемости для хромогенного маркера - о-нитрофенил-ß-D-галактопиранозида (ONPG). Изучение липополисахарид-связывающей активности пептидов проводили с помощью Лимулюс теста (Quantitative Chromogenic Limulus Ame-bocyte Lysate; Lonza, США) с использованием методов и подходов, описанных в [6]. Анализ гемолитической активности пептидов выполняли, как изложено [6], используя эритроциты человека, полученные по стандартной методике из крови здоровых доноров. Оценку токсичности пептидов в отношении культивируемых клеток линии К-562 (эритромиелоидный лейкоз человека) проводили с использованием витального красителя трипанового синего.
Результаты и обсуждение. Исследована антибактериальная активность структурно различных пептидов семейства кателици-динов - кателицидина человека LL-37, про-тегрина 1 свиньи (PG1), бактенецинов козы ChBac5, ChBac3.4 - и изучено влияние на нее компонентов инкубационной среды. С использованием метода радиальной диффузии показано, что все исследуемые АМП обладают высокой антимикробной активностью, как в отношении грамотрицательных, так и грам-положительных бактерий, включая штамм устойчивого к метициллину золотистого стафилококка (MRSA), устойчивых к ряду антибиотиков клинических изолятов Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp., Acinetobacter bauman-nii, Staphylococcus intermedius, в среде с низкой ионной силой. (табл.).
В среде, содержащей тот же буфер, но с добавлением 150 мМ хлорида натрия, антимикробное действие пептидов изменяется. Антибактериальная активность кателициди-на человека LL-37 снижается в присутствии 150 мМ NaCl в отношении большинства исследованных штаммов бактерий, в то время как активность PG1 практически не меняется при повышении концентрации NaCl. Активность бактенецинов падает в прсутствии 150 мМ NaCl в отношении стафилококков, но сохраняется в отношении грамотрицательных бактерий. При анализе антимикробных свойств этих пептидов методом серийных разведений в жидкой питательной среде наблюдаются сходные тенденции - снижается активность бактенецинов в отношении стафилококков, но сохраняется против грамотрицательных антибиотикоустойчивых бактерий, что находится в согласии с данными литературы для бактенецинов быка. Известно, что антимикробная активность большинства лекарственных средств и природных АМП снижается в присутствии компонентов сыворотки крови. Из табл. видно, что активность исследуемых пептидов в присутствии 10% сыворотки крови коров снижается в 2-4 раза, но остается достаточно высокой. Действие исследуемых АМП на мембрану бактерий отличается - в то время, как PG1 и LL-37 вызывают быстрое увеличение проницаемости цитоплазматической мембраны E.coli ML35p для маркерной молекулы, бактеницины проявляют значительно менее выраженный эффект. Однако ChBac3.4 оказывает несколько более существенное воз-
действие на проницаемость мембраны бактерии, чем менее гидрофобный пептид СЬВас5.
Все исследованные АМП демонстрируют липополисахарид-связывающую активность. ЭК50 (эффективные концентрации, при которых 50% ЛПС находится в связанном с пептидами состоянии) были сходными и находились в диапазоне концентраций 1-5 мкМ. LL-37 имел наиболее выраженную активность (ЭК50 =1.0 мкМ).
Важной характеристикой соединений, на основе которых предполагается разработка лекарственных средств, является степень их токсичности для клеток человека. Показано, что бактенецины не проявляют гемолитиче-
ских свойств в отношении эритроцитов человека в диапазоне концентраций 1-64 мкМ, в то время как LL-37 и PG1 проявляют существенную гемолитическую активность, причем PG1 вызывает лизис эритроцитов человека уже в концентрации 10 мкМ. Токсичность в отношении культивируемых клеток линии К562 также в наибольшей степени проявлет PG1. Уже после 10 мин инкубации пептида в концентрации 5 мкМ и выше с клетками-мишенями количество жизнеспособных клеток снижается (р<0.05, по сравнению с контролем - не обработанными пептидом клетками, 11-критерий Стьюдента). Кателицидин человека LL-37 тоже вызывает быстрое снижение
Таблица. Антимикробная активность пептидов (минимальные ингибирующие концентрации пептидов, мкМ)
пептид состав среды E.coli ML35p P. aeruginosa клин. изолят Klebsiella spp. клин. изолят Acineto-bacter baumannii кл. изол. L.mono-cytogenes EGD MRSA ATCC 33591 S.intermedius клин. изол.
LL-37 1* 0.7+0.1 1.3+0.3 0.9+0.1 0.8+0.1 0.9+0.1 2.6+ 3.4
2* 5.8+1.0 4.5+0.4 3.4+0.4 3.2+0.3 2.3+0.2 >32 >32
3** 8 16 8 8 4 >32 >32
4** 16 >32 16 32 16 >32 >32
PG1 1* 0.3+0.1 0.4+0.1 03+0.1 0.6+0.2 0.2+0.1 0.4+0.1 0.7+0.2
2* 0.3+0.1 0.8+0.2 0.4+0.1 0.8+0.2 0.2+0.1 0.5+0.1 0.6+0.2
3** 1 1 1 2 1 2 2
4** 2 2 2 2 2 4 4
ChBac5 1* 0.4+0.1 0.3+0.1 0.3+0.1 0.2+0.1 0.6+0.1 1.4+0.3 3.4+0.5
2* 0.4+0.1 2.8+0.5 1.5+0.4 0.2+0.1 1.8+0.4 >32 >32
3** 2 4 2 2 4 >32 >32
4** 4 8 8 8 8 >32 >32
ChBac3.4 1* 0.4+0.1 0.4+0.1 0.3+0.1 0.3+0.1 0.5+0.1 0.8+0.2 1.2+0.3
2* 0.4+0.1 1.0+0.2 1.1+0.2 0.2+0.1 1.2+0.2 >32 >32
3** 2 2 2 2 4 16 >32
4** 4 4 8 4 8 >32 >32
Состав среды:
1 - агарозный гель, приготовленный на 10 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7.4 (НФБ);
2 - агарозный гель, приготовленный на НФБ с 150 мМ NaCl;
3 - питательный бульон Мюллера-Хинтон с НФБ, содержаще
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.