ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 3, с. 286-295
^ ^^^^^^ ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ
И ЧЕЛОВЕКА
УДК 612.[015.03+332.7+82]:546.[57+59]:541.182.642:539.163
ИЗУЧЕНИЕ БИОНАКОПЛЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА И ЗОЛОТА В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ КРЫС МЕТОДОМ НЕЙТРОННО-АКТИВАЦИОННОГО АНАЛИЗА
© 2014 г. Ю. П. Бузулуков*, Е. А. Арианова**, В. Ф. Демин*, И. В. Сафенкова***,
И. В. Гмошинский**, В. А. Тутельян**
*РНЦ "Курчатовский институт", 123182Москва, пл. Курчатова, 1 **Научно-исследовательский институт питания РАМН, 109240 Москва, Устьинский пр., 2/14 ***Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский просп. 33, стр. 2
E-mail: gmosh@ion.ru Поступила в редакцию 06.03.2013 г.
Изучено бионакопление наночастиц (НЧ) серебра и золота средних размеров 35 и 6 нм соответственно при внутрижелудочном введении крысам в дозе 100 мкг/кг массы тела в течение 28 или 14 сут. Органы и ткани (печень, почки, селезенка, сердце, гонады, головной мозг, кровь) подвергали активации тепловыми нейтронами, после чего определяли активность образующихся в составе НЧ 110мА и 198Au. НЧ обоих металлов были выявлены во всех изученных биологических образцах, причем наибольшие масса и удельное содержание НЧ Ag обнаруживались в печени, а НЧ Au — в почках животных. Отмечено, что содержание НЧ Ag в головном мозге составляло 66.4 ± 5.6 нг (36 нг/г ткани), не более 7% этих НЧ было локализовано в просвете кровеносных сосудов органа. Выявленные в органах и тканях крыс содержания НЧ Ag и Au в соответствии с известными данными литературы могут быть расценены как неопасные (нетоксичные).
DOI: 10.7868/S0002332914030059
Наночастицы (НЧ) и наноматериалы рассматриваются в настоящее время как фактор, способный оказывать неоднозначное, в том числе токсическое, воздействие на организм человека (Онищенко, Тутельян, 2007; Онищенко и др., 2007; Хотимченко и др., 2009; Гмошинский и др., 2010). В составе пищевых продуктов НЧ могут присутствовать как контаминанты (компоненты, мигрировавшие из упаковочных материалов) либо как преднамеренно вносимые пищевые добавки и биологически активные добавки (БАД) к пище (СИаиёИгу в1 а1., 2008; Верников и др., 2009; Невзорова и др., 2009). Среди разнообразия искусственных наноматериалов НЧ серебра (Л§) и золота (Ли) относятся к наиболее популярным продуктам наноиндустрии. Их применение быстро расширяется в области производства антимикробных средств, косметической продукции, упаковочных материалов и БАД к пище (НЧ Л§), а также в медицине при диагностике и в качестве средств доставки лекарственных препаратов к пораженным органам и тканям (НЧ Ли). Поэтому оценка безопасности этих наноматериалов, а также изучение их всасывания, биораспределения и сродства к различным органам и тканям — важная задача.
Такие методы выявления и идентификации НЧ в биологических объектах, как трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) (Tiede etal., 2008; Распопов и др., 2012), не во всех случаях способны зарегистрировать в организме поступившие пероральным путем НЧ, поскольку их содержание в органах и тканях может быть очень низким. В случае НЧ благородных металлов, для которых не характерны процессы биотрансформации в организме (Abdelhaim, Jarrar, 2012; Levard et al., 2012; Walczak et al., 2013), альтернативой при изучении их всасывания и распределения по органам и тканям могут быть методы элементного анализа. Существенно, что содержание таких элементов, как Ag и Au, в норме в организме очень низкое. На его фоне можно легко выявить присутствие НЧ этих металлов, поступающих в организм из окружающей среды. Один из высокочувствительных методов определения элементного состава абиотических и биологических объектов — нейтронно-активационный анализ (НАА), состоящий из обработки образцов интенсивным потоком тепловых нейтронов в исследовательском ядерном реакторе (Кузнецов, 1974). В результате этого атомы химических элементов, входящих в состав НЧ, поглощая нейтроны, становятся радиоактивными, т.е. выполняют функцию метки, маркирующей НЧ. Как правило, при этом обра-
зуются активные нуклиды в- или в+, являющиеся также источниками характеристического у-излу-чения в узком спектральном диапазоне энергий. Их активность, пропорциональная содержанию изучаемого элемента в образце, регистрируется с помощью чувствительного низкофонового у-спек-трометра. К преимуществам этого метода относятся очень высокая чувствительность, отсутствие необходимости сложной пробоподготовки (минерализации) образцов и возможность одновременного мониторинга ряда элементов, входящих в состав нескольких наноматериалов, вводимых животному одновременно, и присутствующих в организме эндогенно.
Цель работы — изучение методом НАА абсорбции и накопления НЧ Ag и Au при их многократном внутрижелудочном введении взрослым крысам.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использован препарат НЧ Ag Арговит (ООО НПЦ "Вектор-Вита", Россия), который представляет собой водную дисперсию НЧ Ag, содержащую 1.0—1.4% по массе Ag и 18.6—19.0% нетоксичного биосовместимого полимера поли-винилпирролидона (ПВП), являющегося разрешенной пищевой добавкой Е1201. Принцип получения препарата в основном совпадает с изложенным ранее (Lee et al., 2008). Препараты Ag данного типа широко используются в России и за рубежом в качестве компонентов БАД к пище, косметической продукции, дезинфекционных средств и других потребительских товаров. По данным ТЭМ (рис. 1а) средний диаметр НЧ составлял 34.9 ± 14.8 (M ± SD), минимальный — 8.4, максимальный — 80.9 нм; форма частиц была близка к сферической (рис. 1в). Методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) было обнаружено, что >89% частиц Ag в препарате имеет диаметр <100 нм (рис. 1д). Существенно более высокое значение среднего диаметра частиц (64.2 ± ± 50.3 нм, M ± SD), определенное данным методом, может быть объяснено наличием на поверхности НЧ протяженных сольватных оболочек ПВП, не различимых при ТЭМ, но влияющих на определение гидродинамического диаметра частиц (Tiede et al., 2008).
НЧ Au были получены по методике Сафенко-вой (Safenkova et al., 2012) в присутствии цитрата натрия. Выбор указанного препарата НЧ Au, полученного по классической технологии, связан с тем, что НЧ данного типа наиболее широко используются в составе медицинских диагностических препаратов, в том числе вводимых in vivo (Day et al., 2010). По данным ТЭМ (рис. 1б) средний диаметр частиц составил 5.8 ± 0.9 (M ± SD), максимальный — 8.5 нм, форма частиц была близка к сферической (рис. 1г). По данным ДЛС >100% частиц имели диаметр <60 нм, средний
диаметр частиц составил 9.74 ± 4.33 нм (M ± SD) (рис. 1е).
В качестве носителя для введения в желудок животных используемых препаратов НЧ применяли деионизованную воду высшей степени очистки согласно ISO 3696 (1987)/NCCLS (1988), полученную с помощью установки MilliQ Advantage A10 (Millipore SAS, Франция).
Исследование проводили на 15 самцах крыс линии "Wistar" исходной массой 100—120 г. Животные получали сбалансированный по всем основным макро- и микронутриентам стандартный полусинтетический корм (Reeves et al., 1993) и питьевую воду (СанПиН 2.1.4.10749-01) в режиме свободного неограниченного доступа. Тестируемые препараты НЧ вводили ежесуточно внутри-желудочно через зонд на протяжении 28 или 14 сут эксперимента.
В эксперименте участвовали три группы животных по 5 крыс. Первая группа — контроль, введение деионизованной воды; вторая и третья — введение НЧ Ag и Au в дозах 100 мкг/кг массы тела в сутки на протяжении 28 и 14 сут соответственно.
На протяжении всего периода кормления животных ежесуточно взвешивали на электронных весах с точностью до ±1 г, фиксировали изменения их внешнего вида и поведения. По окончании эксперимента животных подвергали глубокой эфирной анестезии и обескровливали из нижней полой вены. Брюшную полость асептически вскрывали, последовательно отбирали стерильными инструментами в одноразовые полиэтиленовые контейнеры печень, почки, гонады, селезенку, сердце, головной мозг. Пробы хранили до анализа при —20°C. Отбор проб и транспортировку образцов в РНЦ "Курчатовский институт" для анализа методом НАА осуществляли в условиях "холодовой цепи".
Нейтронную активацию изотопов, входящих в состав НЧ Ag и Au, осуществляли путем облучения потоком тепловых нейтронов (0.005 эВ < En < < 0.4 эВ) в вертикальном экспериментальном канале ВЭК-9 ядерного реактора ИР-8 (Россия). Среднее значение плотности потока нейтронов за время облучения составляло 4.7 х 1012 см-2 • с-1. Биологические образцы с НЧ Ag облучали в течение 24 ч. Биологические образцы с НЧ Au были разделены на две партии в соответствии с их массой; при этом образцы с большой массой (печень, селезенка, почки) облучали в течение 3 ч, образцы с малой массой - в течение 22 ч. Это было вызвано в первую очередь необходимостью непревышения активностью отдельных образцов норм радиационной безопасности.
Одновременно с исследуемыми образцами проводили активацию эталонных образцов НЧ Ag и Au в виде водных дисперсий, помещенных в
30 -
20 -
10 -
40
(д)
6
(е)
16 12 8 4
10-
100
101
102
103
10-
100
101
102
103
Рис. 1. Результаты физико-химической характеристики НЧ Ag (а, в, д) и Ли (б, г, е). а, б — микрофотографии частиц, полученные методом ТЭМ на микроскопе JEM-100CX/SEG (1ео1, Япония), ускоряющее напряжение 80 кВ, увеличение 30000 и 100000 соответственно. в, г — распределение частиц по диаметру по данным ТЭМ: ось абсцисс — диаметр частиц, нм; ось ординат — число частиц. д, е — распределение частиц по гидродинамическому диаметру по данным ДЛС: ось абсцисс — гидродинамический диаметр, нм; ось ординат — доля общего числа частиц, %.
0
контейнеры, геометрия которых соответствовала контейнерам для биологических образцов. После окончания цикла облучения и выведения препаратов из активной зоны реактора их выдерживали
внутри биозащиты не менее 10 сут для уменьшения фона у-излучения короткоживущих изотопов (в основном 24№, и 29Л1 с периодами полураспада Т1/2 = 14.8, 2.6 и 0.11 ч соответственно), обра-
Таблица 1. Характеристики исходных и активированных изотопов элементов, участвующих в реакции нейт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.