БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 1, с. 88-94
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.3
ИЗУЧЕНИЕ ДИФФУЗИИ P ЕДОКС-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ НИТРОКСИЛЬНЫХ СПИНОВЫХ ЗОНДОВ ЧЕРЕЗ БИ СЛОЙНЫЕ ЛИПИДНЫЕ МЕМБРАНЫ ПО ДАННЫМ 300 МГц ЭПР-СПЕКТРОМЕТРИИ
© 2015 г. А.М.Ф. Бениал, М.К. Дхас, К. Ичикава*, К. Ямада*, Ф. Хуодо**,
А. Джавахар***, X. Уцуми*
Физический факультет, NMSSVN Колледж, Нагамалаи, Мадурай-625 019, Тамилнад, Индия;
*Факультет биофункциональных наук, факультет фармацевтических наук, Университет Кюсю,
Фуку ока, Япония;
**Инновационный центр медицинской редокс-навигации, Университет Кюсю,
Фукуока, Япония;
***Химический факультет, NMSSVN Колледж, Нагамалаи, Мадурай-625 019, Тамилнад, Индия
E-mail: Ыйео.Ш$ыт1.278@т.кушкы-и.ас.]р Поступила в p едакцию 10.06.13 г.
П роведено ЭП P-исследование 14^меченых дейтерированных 3-метоксикарбонил-2,2,5,5-тетра-метил-пирролидин-1-оксила (МК-П РОКСИЛ) и 3-карбокси-2,2,5,5-тетраметил-1-пирролидин-1-оксила (карбокси-П РОКСИЛ) в чистой воде и в липосомальных р астворах разной концентрации на 300 МГц ЭПР-спектрометре. Регистрировали такие ЭПР-параметры, как ширину линии, константу сверхтонкой структуры, время вращательной корреляции, g-фактор, параметр распределения и проницаемость. В липосомальных растворах наблюдали увеличение ширины линии для МК-ПРОКСИЛа и карбокси-ПРОКСИЛа. Постоянная сверхтонкой структуры регистрировалась для обоих нитроксильных спиновых зондов. Было продемонстрировано свойство нитроксильных спиновых зондов проникать и не проникать через мембрану. Время вращательной корреляции увеличивалось с увеличением концентрации липосом для M К -ПРОКСИЛа, что указывает на диффузию нитроксильных спиновых зондов в липидную мембрану. Значение проницаемости (R) уменьшалось с увеличением концентрации липосом, что говорит об увеличении проницаемости мембраны. Пик, соответствующий липидной фазе, был зарегистрирован в ра створе липосом для M К -П РОКСИЛа, но не для карбокси-П РОКСИЛа. Результаты подтверждают, что нитроксильные спиновые зонды способны проникать или не проникать в липидный слой в зависимости от их природы.
Ключевые слова: электронный парамагнитный резонанс, свободные радикалы, липосомы, проницаемость.
Биологические мембраны - это динамические структуры с липидным содержимым, известные своей асимметричностью и гетерогенностью [1]. Липосомы - замкнутые структуры, состоящие из амфифильных липидов, формирующих бислой вокруг водной составляющей. Липосомы имеют структуру мембраны, близкую к клеточной, в которой липофильная углеводородная область зажата между двумя упо -рядоченными областями полярных головок [2]. Липосомы являются удобной моделью клеточной мембраны для изучения влияния некоторых
Сокращения: МК-П РОКСИЛ - 3-метоксикарбонил-2,2,5,5-тетраметил-пирролидин-1-оксил, карбокси-П РОКСИЛ - 3-карбокси-2,2,5,5-тетраметил-пирролидин-1-оксил.
пар аметров, таких как вязкость или плотность поверхностного заряда, на распределение гидрофобных сенсибилизирующих агентов в нормальных и опухолевых тканях [3].
ЭПР-спектроскопия липидов со спиновыми метками уже давно зарекомендовала себя как ценный метод изучения динамики вр ащения и молекулярной упорядоченности в липидных бислоях и биологических мембранах путем выявления неспаренных электронов и радикалов в биологических молекулах [4]. ЭПР является мощным неинвазивным спектро скопическим инструментом, который может быть использован для контроля процесса высвобождения лекарственных средств in vitro и in vivo [5].
Магнитные взаимодействия нитроксильных спиновых меток чрезвычайно чувствительны к движению по наносекундной шкале вр емени в ЭП Р Х-диапазоне частот (~ 9 ГГц), что имеет большое значение для изучения динамики биомолекул [4]. ЭПР Х-диапазон непригоден для исследования интактных животных или даже оперативно удаленных органов. Для ЭПР-ис-следования подобных объектов необходимо уменьшить частоту электромагнитного излучения, чтобы оно не было полностью поглощено за счет нерезонансных взаимодействий. Это достигается уменьшением магнитного поля, при котором работает спектрометр. В последнее время исследовательские группы разработали приборы с ЭП Р-диапазоном частот от 200 МГц до 1,5 ГГц. ЭПР-спектрометр с частотой 300 МГц используется для обнар ужения свободных радикалов, введенных или имплантированных в живых животных. Даже в этих диапазонах частот остается некоторая степень поглощения в биологических образцах, ограничивающая глубину проникновения электромагнитного излучения. В результате спектрометры Ь-диапа-зона, как пр авило, используются для исследования животных размером не больше мышей (~ 25 г массы тела), в то время как крысы (~ 250 г массы тела) могут быть исследованы ЭПР-спектрометром на радиочастотах [6-8].
В транспорте многих видов молекул, в частности, глюкозы, аминокислот, ионов металлов, представляющих биологический интерес, задействованы переносчики и белки-каналы, пассивная диффузия в биомембранах является преобладающим механизмом для многих про -никающих веществ, в том числе липофильных молекулы препаратов, а также низкомолекулярных полярных соединений. Проведенные исследования обеспечили понимание механизма, обеспечивающего химический со став липидного бислоя и физические состояния мембраны [9]. С помощью отслеживаемых методом ЭП Р ли-пидных спиновых меток (свободнорадикальных нитроксилов), расположенных на разных глубинах в мембране, могут быть получены про -фили различных свойств мембраны для поперечны х сечений бислоя [10]. Такой подход может обеспечить точную оценку молекулярной динамики и упорядоченности липидов рогового слоя, может быть использован для исследования взаимодействия липидов с препаратом непо-ср едственно в нативном роговом слое, а также в случае различных кожных заболеваний и поражений [11]. Метод спиновых меток может быть полезным для понимания свойств окисленных липидных пузыр ьков, содержащих фос-фолипиды [12]. Взаимодействие противоопухо -
левого пр епарата даунор убицина c липосомами показывает, что электростатические и гидро-фобные силы необходимы для стабилизации антрациклинов в липидном бислое [13].
Сообщалось об исследованиях динамической ядер ной поляризации редокс-чувствитель-ных мембран проникающими и непроникающими нитроксильными спиновыми зондами в липосомальном раствор е. Было показано, что магнитно-резонансная томография Оверхаузера (МРТ) может использоваться для различения воды внутри и вне мембраны путем введения липосомных везикул с липидно-проникающими нитроксильными спиновыми зондами [14]. Бе-ниал с соавторами сообщили об исследовании с помощью ЭП Р-спектр ометра L-диапазона способности редокс-чувствительных нитро -ксильных спиновых зондов проникать через ли-пидные мембраны [15]. Многие исследователи недавно сообщали о ЭП Р- и М РТ-экспер имен-тах in vivo над маленькими животными на низких частотах (300 МГц). Для лучшего понимания ЭПР-параметров в данной работе мы исследовали процесс диффузии проникающих и непр оникающих в липидный слой нитроксильных радикалов в чистой воде и в липосомаль-ных растворах различных концентраций при помощи ЭПР-спектрометра с частотой 300 МГц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Спиновая метка, 14К-меченый дейтериро-ванный 3-карбокси-2,2,5,5-тетраметил-пирроли-дин-1-оксил (карбокси-ПРОКСИЛ), и яичный L-a-фосфатидилхолин были получены от Al-drkh (США). 14К-меченый дейтерированный 3-метоксикарбонил-2,2,5,5-тетраметил-пирролид ин-1-оксил (МК-П РОКСИЛ) был синтезирован, как описано выше [16]. Все остальные химические вещества были аналитической чистоты.
Приготовление мультиламеллярных липо-сом. Мультиламелллярные липосомы получали следующим обр азом [16]: яичный фосфатидил-холин сначала растворяли в хлороформе, который позднее удаляли на роторном испарителе с получением тонкой пленки на стенках кр уг-лодонной колбы. Пленку тщательно сушили в вакууме в течение примерно двух часов. Сухие липиды суспендировали в фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем спиновые зонды, затем вихревым смесителем подготавливали суспензии липосом с конечной концентрацией липида 100, 200, 300 и 400 мМ. Нитроксильные спиновые зонды добавляли к липосомальному раствору и кратко обрабатывали ультразвуком в течение одного часа при 23°С.
Определение размера частиц. Размер частиц липосом после экструзии суспензии через поликарбонатный фильтр был определен свето-ра ссеивающим спектрофотометром Zetasizer Nano (Ма1уегп, Великобритания) и со ставил ~ 100 нм.
ЭПР измерения. Работа была выполнена на 300 M Гц ЭП Р-спектр ометре пр и 23°С [16]. ЭП Р-спектры были зарегистрированы для 2 мМ растворов 14^меченого дейтер ир ованного проникающего МК-ПРОКСИЛа в чистой воде и в липосомальных растворах с концентр ацией 100, 200, 300, 400 мМ, а также непроникающего карбокси-П РОКСИЛа в чистой воде и в липо-сомальном растворе с концентрацией 400 мМ при изменении магнитного поля от 8 до 13 мТл, модулирующей частоте 100 кГц, амплитуде модуляции поля 0,1 мТл, временной константе 30 мс, р адиочастотной мощности 100 мВт, ширине развертки ± 2,5 мТл и радиочастоте 300 МГц. Спектр ЭПР записывали в режиме первой производной пр и 27°С. Для удаления кислорода из раствора через образцы около двух часов пропускали ар гон. Образцы готовили на фосфатном буфере, рН 7,4. Образцы с р азличной концентрацией липосом помещали в капсулу диаметром 2 см. При каждом измерении капсула была заполнена образцом на 5 см в длину, объем обр азца составлял 10 мл. Для того чтобы избежать потери воды во время измерений, ампулы были запечатаны с обеих сторон. Температуру поддерживали с помощью водяного термостата.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В гетерогенной мембране области, различающиеся одним или несколькими свойствами текучести, называются доменами. Экспериментальный спектр ЭПР представляет собой суперпозицию спектральных компонент, соответствующих спиновым зондам в мембранных доменах с различными характеристиками текучести. Спектры ЭПР исследованных растворов приведены на рис. 1 и 2. Параметры спектр ов, такие как ширина линии, константа сверхтонкой структуры, время вращательной корреляции и величина ^-фактор а, приведены в табл. 1. В табл. 2
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.