ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 45, № 5, с. 538-543
УДК 577.151.01
ИЗУЧЕНИЕ ДВУХ АЛКАЛОТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ РОДА Anoxybacillus КАК ПРОДУЦЕНТОВ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕИНАЗ
© 2009 г. Е. В. Лаврентьева*, А. П. Шагжина*, О. Б. Бабасанова*, Я. Е. Дунаевский**,
3. Б. Намсараев***, Д. Д. Бархутова*
*Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ, 670047 **НИИ физико-химической биологии им. АН. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, 119991
e-mail: dun@belozersky.msu.ru ***Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, 117312, Москва
e-mail: nzb@mail.ru Поступила в редакцию 30.07.2008 г.
Из гидротерм Байкальского региона выделены и охарактеризованы два штамма алкалотермофиль-ных бактерий, принадлежащих роду Anoxybacillus. Показано, что секретируемые протеиназы этих штаммов обладали широкой субстратной специфичностью, гидролизовали белки и n-нитроанилид-ные субстраты, проявляя максимальную активность при гидролизе n-нитроанилида пироглутамил-аланил-аланил-лейцина. Установлено, что протеиназы наиболее активны в щелочном диапазоне рН (10.0-10.5), термостабильны и характеризуются широким температурным оптимумом (55-70°). Результаты ингибиторного анализа и изучения субстратной специфичности внеклеточных ферментов указывают на их принадлежность к классу сериновых протеиназ субтилизин-подобного типа.
Щелочные гидротермы Байкальского региона являются экстремальными экосистемами, представляющими значительный интерес как для фундаментальных исследований, так и практического использования. Термофильные, алкалофильные и алкалотолерантные бактерии этих гидротерм подобно другим экстремофилам, являясь продуцентами промышленно значимых ферментов, привлекательны повышенной устойчивостью промышленных штаммов к контаминации посторонней микрофлорой, что крайне важно в производстве стандартизованных ферментных препаратов. Известно, что большинство ферментов, используемых до настоящего времени в коммерческих целях, получено из мезофильных микроорганизмов. Однако применение этих ферментов ограничено вследствие их низкой стабильности при экстремальных значениях температуры и рН. Термофилы же водных экстремальных экосистем могут стать уникальными источниками термостабильных ферментов, многие из которых существенно отличаются от известных наземных филотипов.
Следует также отметить, что в связи с постоянством химического состава и температуры воды горячие источники являются удобными модельными системами для изучения экологии обитающих в них организмов [1, 2]. Ферменты, функционирующие в экстремофильных условиях, определяют метаболические процессы и специфические биологические функции этих микроорганизмов в местах обитания. Среди секретируемых ими внеклеточных ферментов важная роль принадлежит про-
теиназам, принимающим активное участие в использовании микроорганизмами органических субстратов [3].
Исследования по выделению, идентификации и классификации протеолитических ферментов в последние годы проводятся особенно интенсивно, что объясняется востребованностью и многообразием различающихся по специфичности протеиназ. Выделенные протеиназы находят применение в различных областях биотехнологии - от индустриального производства гидролитических ферментов для детергентов до использования в генетических и молекулярно-биологических исследованиях [4-6]. Протеиназы из алкалофиль-ных бактерий применяются при дублении кожи, в пивоварении и производстве специфических детергентов. Они составляют около 60% от количества всех производимых ферментов [6-8]. Большая часть ранее проведенных исследований по изучению протеолитической активности и ее регуляции у аэробных термофилов, выделенных из различных высокотемпературных систем, была выполнена на бактериях рода Bacillus [8-10]. Исследования, касающиеся внеклеточной протеолитической активности гетеротрофных алкалотер-мофильных бактерий из термальных щелочных источников Байкальского региона, практически полностью отсутствуют.
Цель работы - характеристика двух штаммов гетеротрофных алкалотермофильных бактерий рода Anoxybacillus и изучение секретируемых ими внеклеточных протеолитических ферментов.
МЕТОДИКА
Источник выделения и условия культивирования. Объектами исследования являлись термофильные аэробные гетеротрофные бактерии, выделенные из донных осадков низкоминерализованных щелочных гидротерм Горячинска (Бурятия) и Цэнхэра (Центральная Монголия). Полученные штаммы обозначены как П1 и Т4 соответственно. Культивирование штамма П1 проводили на мясо-пептонном бульоне, штамма Т4 - на среде следующего состава (г/л): KH2PO4 - 9.3; (NH4)2SO4 - 1.92; MgSO4 - 0.18; цитрат натрия - 1.29; глюкоза - 19.0, в колбах емкостью 250 мл при 55°С в статических условиях, рН сред был 7.5-8.5. Чистые культуры были получены путем высева суспензии микроорганизмов из накопительной культуры на питательный агар и последующих пересевов.
Микроскопические методы. Морфологию бактерий изучали на живых и фиксированных препаратах, окрашенных по Граму, используя световой микроскоп Olympus BX-41 ("Olympus", Япония) с иммерсионной системой.
Биохимические тесты и методы анализа. Возможность использования алкалотермофильными бактериями различных веществ в качестве источников углерода и энергии и способность к росту при различных значениях температуры и pH определяли на среде следующего состава (г/л): NH4CI - 0.4; KH2PO4 - 0.5; NaNO3 - 0.4; MgCI2 -0.2; Na2SO4 - 0.5; NaCl - 0.5; KCl - 0.5; дрожжевой экстракт - 0.1; раствор микроэлементов по Пфеннигу - 1 мл; витамин В12 - 20 мкг. Углеводы стерилизовали отдельно и стерильно вносили в среду в концентрации 1%.
Способность бактерий продуцировать аммиак и индол выявляли с помощью реактивов Несслера и Эрлиха соответственно [11]. Каталазную активность определяли, используя 10%-ный раствор перекиси водорода [11]. Присутствие оксидазы в культурах оценивали по образованию индофенола в результате окислительно-восстановительных реакций с ^диметил-1,4-фенилендиамином и а-нафтолом [12, 13].
Для выяснения оптимальных параметров роста и определения границ термо- и алкалотолерантно-сти выделенных культур были проведены лабораторные эксперименты по выращиванию их в градиентном термостате. Требуемый рН устанавливали, используя различные концентрации бикарбоната и карбоната натрия.
Накопление биомассы бактерий оценивали по изменению оптической плотности культуры при 650 нм на фотометре КФК-20 (Россия).
Молекулярно-генетический анализ. ДНК изученных культур выделяли по методу Мармура [14]. Выделение и очистка ДНК проведены в Институте микробиологии РАН (г. Москва).
Амплификацию генов 16S рРНК осуществляли с универсальными праймерами 27f и 1492г на приборе GeneAmp PCR System 2700 ("Applied Biosystems", США). Секвенирование амплифициро-ванного фрагмента гена 16S рРНК проводили на автоматическом секвенаторе ДНК CEQ2000XL ("Beckman Coulter", США) с использованием набора секвенирующих реагентов Dye Terminator Cycle Sequencing ("Beckman Coulter", США). Амплификация и секвенирование генов 16S рРНК проведены в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г. Пущино) и в Лимнологическом институте СО РАН (г. Иркутск). Поиск нуклеотидных последовательностей в базе данных GenBank осуществляли с помощью программы BLASTn.
Определение протеолитической активности.
Культуры инкубировали при 55°С на комплексной минеральной среде в течение 12 и 24 ч. После инкубации клетки осаждали центрифугированием (13000 g, 15 мин), полученный супернатант использовали для определения активности протеаз.
Для качественной оценки наличия или отсутствия протеолитической активности в выделенных штаммах была определена степень гидролиза желатины. Культуры высевали на мясо-пеп-тонный бульон, содержащий 10% желатины, и разжижение желатины отмечали визуально [12].
Общую активность измеряли по гидролизу 1%-ного раствора желатины (рН 8) с помощью метода тринитрофенилирования [15]. Специфическую активность секретируемых протеаз определяли, используя в качестве субстратов 5 мМ я-нитроанили-ды: N-бензоил-Ь-аргинина (БАЛА), пироглутамил-аланил-аланил-лейцина (ГААЛЛ) и фенилаланина (ФЛА). Для определения этой активности смешивали 700 мкл 0.1 М фосфатного буфера (рН 7.0), 10 мкл раствора субстрата и 50 мкл культуральной жидкости. Реакционную смесь инкубировали в термостате при 37°С в течение 1 ч. Количество образовавшегося продукта (я-нитроанилина) определяли на спектрофотометре Genesys 10 ("Thermo Spectronic", США), измеряя величину D410 [16].
Определение оптимума pH-активности и pH-стабильности фермента. При определении оптимума pH действия секретируемой протеиназы по отношению к синтетическим субстратам были использованы следующие буферные растворы (0.02 М): цитратно-фосфатный, трис-HCl и глицин-NaOH, имеющие рН в диапазоне от 2.9 до 11.6. Определение зависимости стабильности ферментов от рН проводили в тех же буферах после 15 мин инкубации, затем ко всем образцам добавляли 10-кратный объем 0.1 М фосфатного буфера (pH 7.0), субстрат и определяли активность, как описано выше.
Определение температурного оптимума и термостабильности. Температурный оптимум фермента определяли, измеряя активность фермента
от 30 до 90°С. Для изучения термостабильности раствор фермента инкубировали при тех же температурах в течение 15 мин, затем доводили до комнатной температуры и определяли активность при 37°С, как указано выше.
Ингибиторный анализ. Для выяснения природы функциональных групп активного центра к 100 мкл раствора фермента добавляли 10 мкл раствора соответствующего ингибитора, инкубировали при 37°С, затем добавляли раствор субстрата и определяли активность, как указано выше. В работе использовались ингибиторы сериновых протеи-наз - фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), трипсиноподобных протеиназ - хлорметилкетон тозил^-лизина (ТЛХК), химотрипсиноподобных протеиназ - хлорметилкетон тозилфенилаланина (ТФХК), цистеиновых протеиназ - йодацетамид (ИАА), металл опротеаз - этилендиаминтетрааце-тат (ЭДТА).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Две термофильные аэробные алкалотолерант-ные гетеротрофные бактерии, штаммы которых бы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.