научная статья по теме ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ИНУЛИНАЗЫ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE И KLUYVEROMYCES MARXIANUS Биология

Текст научной статьи на тему «ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ИНУЛИНАЗЫ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE И KLUYVEROMYCES MARXIANUS»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 1, с. 37-42

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 577.21:577.1:663.12

ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ИНУЛИНАЗЫ ДРОЖЖЕЙ

злссилюмусеб сеяеушме и кьиууеюмусез мляхмтз

© 2015 г. Г. Г. Соколенко*, 1, Н. А. Карпеченко**

ФГБОУВПО Воронежский государственный аграрный университет им. императора Петра I ФГБОУВПО Воронежский государственный университет Поступила в редакцию 06.05.2014 г.

Изучена экспрессия генов ферментов, участвующих в метаболизме инулина, сахарозы и глюкозы дрожжей Saccharomyces еегеу1$1ае и К1иууегошусв8 шатапт. Определена экзон-интронная структура исследуемых генов, подобраны и оптимизированы праймеры для проведения количественной ПЦР, установлена зависимость показателя экспрессии генов от источника углерода. Показано, что глюкоза оказывает репрессивный эффект на синтез инулиназы К1иууегошусе8 шагх1апи5, а сахароза является индуктором, тогда как для инулиназы Saccharomyces сегеу151ае глюкоза является индуктором, а сахароза — репрессором.

Ключевые слова: Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, источник углерода, гликозидаза, инулиназа, экспрессия, ПЦР, праймер.

DOI: 10.7868/S0026365615010140

Гликозидгидролазы (или гликозидазы, К.Ф. 3.2.1.) являются одной из самых широко применяемых и изученных групп ферментов. Эта группа включает ферменты семейства GH32, катализирующие гидролиз гликозидных связей углеводов (сахарозы, различных олиго- и полисахаридов, фрук-танов — левана и инулина). Большой практический интерес представляет фермент инулиназа (2,l-P-D-фруктан-фруктаногидролаза, КФ 3.2.1.7), гидроли-зующий Р-2,1-связи инулина до фруктозы и фрук-тоолигосахаридов, которые широко применяют в медицине и пищевой промышленности при получении функциональных продуктов питания. Применение инулиназы для гидролиза инулинсодер-жащего сырья позволяет получать фруктозу ферментативным путем в одну стадию без участия трех ферментов: а-амилазы, глюкоамилазы и глюко-зоизомеразы, необходимых при получения фруктозы из крахмала. Инулиназы синтезируют представители 15 родов грибов, 12 родов дрожжей и 8 родов бактерий. Дрожжи являются лучшими продуцентами инулиназ по сравнению с грибами и бактериями, их легче культивировать, они могут синтезировать большие количества инулиназы [1, 2]. Представители вида Kluyveromyces marxianus — наиболее широко применяемые и изученные продуценты инулиназы. В настоящее время инулазо-активные штаммы этих дрожжей используют для получения биотопливного этанола из инулинсо-

1 Автор для корреспонденции (e-mail: galigri@mail.ru).

держащего сырья, что позволяет объединить процессы осахаривания и сбраживания [3]. В то же время известно ограниченное число продуцентов инулиназ среди дрожжей Saccharomyces cerevisiae, недостаточно изучены свойства фермента и механизмы его регуляции [4, 5]. Широкое применение инулиназ требует поиска новых источников этих ферментов, изучения их свойств, определения строения и регуляции соответствующих генов.

Большая часть исследований по регуляции экспрессии генов инулиназы дрожжей выполнены на различных штаммах K. marxianus. Существуют литературные данные о влиянии источника углерода на синтез инулиназы. Gupta и соавт. (1994) было показано, что в процессе синтеза инулиназы K. marxianus глюкоза отвечает за ката-болическую репрессию, в то время как сахароза и фруктоза выступают в качестве слабых индукторов, по сравнению с инулином [6]. Для другого штамма этих дрожжей, K. marxianus CDBB-L-278, не выявлено каких-либо механизмов индукции [7]. В исследованиях Gao и соавт. (2012) активность инулиназы K. marxianus YX01 была выше при использовании в качестве источника углерода инулина по сравнению с глюкозой или фруктозой, глюкоза оказывала репрессирующее действие, а повышение ее концентрации вызывало ингибирующий эффект [3].

Исследования влияния различных углеводов на биосинтез инулиназы дрожжей S. cerevisiae ВГШ-2 показали индукцию синтеза фермента

под действием фруктозы, сахарозы и инулина. На среде с глюкозой установлен относительно низкий уровень инулиназной активности [4]. 8Пуа-8апЙ81еЪап и соавт. (2009) был сделан вывод, что механизмы регулирования синтеза инулиназы сложны и зависят от штамма [8]. На сегодняшний день недостаточно данных для заключения о детальном механизме регуляции синтеза инулиназы. В связи с этим сравнительное изучение регуляции экспрессии генов Р-фруктозидаз в клетках дрожжей К. шатапт и Б. сегеу181ае является актуальным.

Целью работы явилось изучение регуляции экспрессии гена инулиназы дрожжей Б. сегеу181ае и К. шатапш при росте в питательных средах с различными источниками углерода (инулином, сахарозой, глюкозой) с помощью метода ПЦР.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили дрожжи К. шатапт ВКМ У-1148, которые были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов и штамм дрожжей Б. сегеу181ае О, полученный нами на основе штамма Б. сегеутае ВКМ У-2902Э из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ИБФМ, Пущино) [9].

Для выращивания дрожжей использовали синтетическую среду (г/л водопроводной воды): 20.0 источника углерода — сахароза, или глюкоза, или инулин; 5.0 - ^Н4)2804; 0.85 - КН2Р04; 0.15 -К2НР04; 0.5 - М§804; 0.1 - №С1; 0.1 - СаС12; 2.0 -дрожжевой экстракт, рН 5.0. Инулин марки Ве-neotmGR ("ОгаШ®Н^', Бельгия). Среду стерилизовали 20 мин при 121°С и инокулировали суспензией дрожжей, полученной смывом с сусло-агара до концентрации 107 кл./мл среды. Дрожжи выращивали на термостатируемой качалке при 200 об/мин в колбах объемом 250 мл с 50 мл питательной среды при 30°С и в течение 24 ч. Биомассу дрожжей отделяли от питательной среды путем центрифугирования при 2600 g в течение 10 мин при 2°С и использовали для получения водного экстракта внутриклеточной инулиназы, а над осад очную жидкость - для определения внеклеточного сек-ретируемого фермента, который содержался в культуральной жидкости. Для выделения внутриклеточного фермента биомассу дрожжей промывали водой и осаждали центрифугированием, подсушивали до влажности 75%, затем растирали в ступке со стеклянным песком и дистиллированной водой в соотношении 1 : 10. Растертую биомассу выдерживали 20 мин при температуре 20°С, после чего проводили центрифугирование для осаждения обломков разрушенных клеток и песка, а полученную надосадочную жидкость использовали для определения активности внутриклеточной инули-назы.

Метод определения инулиназной активности основан на определении редуцирующих веществ, освобождающихся в процессе гидролиза субстрата под действием фермента. За единицу инулиназной активности принимали такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкг редуцирующих веществ за 1 мин в условиях эксперимента. Для определения активности инулиназы смешивали 2 см3 раствора инулина с массовой долей 5% в 0.1 моль/дм3 ацетатном буфере (pH 4.7) и 1 см3 экстракта дрожжей, смесь инкубировали в течение 20 мин при 50°C. В контрольную пробу добавляли ферментный экстракт, прогретый на кипящей водяной бане в течение 1—2 мин. Содержание фруктозы в пробах определяли по методу Починка [10]. Инулиназную активность рассчитывали по формуле:

A — A — An

180лх '

где A — активность фермента, ед/г;

A0 — количество редуцирующих веществ, образовавшихся в результате гидролиза инулина, мкг;

An — количество редуцирующих веществ в контрольной пробе, мкг;

n — количество ферментного экстракта, см3;

т — время гидролиза, мин.

Для изучения регуляции экспрессии генов инулиназы исследуемых штаммов дрожжей был проведен дизайн и подбор пар праймеров к генам ß-фруктозидаз дрожжей S. cerevisiae и K. marx-ianus. Праймеры выбирали на основе нуклеотид-ной последовательности экзонов генов ß-фрукто-зидаз дрожжей K. marxianus и S. cerevisiae из базы данных National Center for Biotechnology Information [11]. С целью обнаружения схожих участков осуществляли множественное выравнивание си-квенсов исследуемых генов, используя онлайн браузер AliBee [12]. Определение температуры отжига праймеров, возможности образования шпилек и сшивок проводили, используя программное обеспечение FastPCR.

Образцы очищенной нуклеиновой кислоты получали по стандартной методике [13]. Выделенную РНК использовали для реакции обратной транскрипции с ферментом обратной транскрип-тазой вируса лейкемии мышей Молони (M-MLV; Sileks, кат. № E1211). Для получения кДНК с матричной РНК методом обратной транскрипции использовали олиго (дТ) праймеры. Реакцию проводили согласно протоколу фирмы производителя.

Полученную ДНК использовали для постановки количественной ПЦР. Использовали реакционную смесь следующего состава: 2.5 мкл 10х ПЦР буфера (100 мМ трис-HCl; рН 8.8; 500 мМ Ка), 25 мМ MgCl2, смесь 10 мМ нуклеотидтрифосфа-

тов, 10 мМ праймера, 1 ед. Taq ДНК-полимеразы, 0.1 мкл разбавленного в 10000 раз красителя SYBR Green и 1 мкл кДНК (20 нг/мкл).

Амплификацию проводили в амплификаторе CFX96 (Touch Real Time System, "Bio-Rad", США) по следующей программе: 1 этап (1 цикл) — денатурация (95°C, 5 мин); 2 этап (35 циклов) — денатурация (95°C, 40 с), отжиг (60°C, 40 с), элонгация (72°C, 1 мин); детекция уровня флюоресценции продуктов амплификации; 3 этап (1 цикл) — элонгация (72°C, 5 мин); охлаждение реакционной смеси.

Нормализацию данных кПЦР осуществляли относительно 4 housekeeping генов: ALG9, TAF10, TFC1, UBC6 [14, 15].

Амплифицированные фрагменты ДНК разделяли методом электрофореза в 1% агарозном геле.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Было установлено, что наиболее высокие значения активности инулиназы исследуемые дрожжи имели при выращивании на среде с инулином, то есть инулин проявлял индуцирующий эффект, при этом активность фермента S. cerevisiae G была выше активности K. marxianus Y-1148 почти в 4 раза (таблица). На среде с сахарозой дрожжи K. marxianus Y-1148 имели активность инулиназы выше, чем на среде с глюкозой в 1.5 раза, а на среде с глюкозой в 2 раза ниже, чем на среде с инулином. Таким образом, синтез инулиназы у этого штамма дрожжей индуцибельный и подвержен катаболитной репрессии глюкозой. Дрожжи S. cerevisiae G при выращивании на среде с глюкозой имели значения инулиназной активнос

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком