УДК 612.017.1:57.052
ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ ЭФФЕКТОВ ТРОФОБЛАСТИЧЕСКОГО Р1-ГЛИКОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА
© 2015 г. С. А. Заморина, М. Б. Раев
ФГБУНИнститут экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь E-mail: mantissa7@mail.ru Поступила в редакцию 25.03.2014 г.
Изучено влияние физиологических концентраций трофобластического в 1-гликопротеина человека (ТБГ) на экспрессию маркеров натуральных киллеров (NK)-, Т-клеток с функциями натуральных киллеров (NKT-) и Т-регуляторных лимфоцитов (Treg), а также на активность индоламин-2,3-диок-сигеназы (IDO) моноцитов и апоптоз лимфоцитов в системе in vitro. Установлено, что ТБГ в высокой концентрации (100 мкг/мл) угнетал экспрессию CD16/56 на NK-клетках, ассоциированную с цито-литической активностью этих клеток. Показано, что ТБГ в низких концентрациях (1 и 10 мкг/мл) усиливал экспрессию CD16/56 на NKT-клетках, связанную с цитокинпродуцирующей активностью. Установлено, что ТБГ увеличивал количество адаптивных Treg в культуре (CD4+FOXP3+ и CD4+CD25 brightFOXP3+), осуществляющих супрессорные функции. Помимо этого, ТБГ стимулировал активность IDO в периферических моноцитах, дополнительно усиливая генерацию Treg. В целом, ТБГ оказывал антиапоптотическое действие на лимфоциты. Описанные эффекты могут определять вклад ТБГ в формирование иммунной толерантности при беременности.
Ключевые слова: трофобластический в1-гликопротеин, NK, NKT, Treg, IDO, апоптоз лимфоцитов.
Б01: 10.7868/80131164615010142
Трофобластический р1-гликопротеин (ТБГ) является онкофетальным белком, который продуцируется во время беременности клетками ци-то- и синцитиотрофобласта. ТБГ играет значимую роль в эмбриональном развитии, приживлении трофобласта и плацентарном ангиогенезе [1, 2]. Известно, что ТБГ обладает выраженными им-муносупрессорными эффектами, подавляя, в частности, пролиферативный ответ митогенсти-мулированных лимфоцитов [2] и угнетая бакте-рицидность фагоцитов [3]. Одновременно, ТБГ индуцирует синтез противовоспалительных ци-токинов (интерлейкин (/Х)-10, 1Ь-6) и трансформирующего фактора роста бета-1 (ТОЕ-р1) [4]. В 2012 г. на мышиной модели продемонстрировано, что ТБГ, воздействуя на дендритные клетки, модулирует активность Т-регуляторных лимфоцитов (Т.е) и продукцию Тй2-цитокинов [5]. В целом, ТБГ вносит вклад в модулирование как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа [6]. Однако роль ТБГ в формировании ключевых факторов иммунной толерантности на модели клеток человека изучена недостаточно.
Изучение эффектов ТБГ затруднено в силу отсутствия в открытом доступе препарата этого белка. Для исследований доступны только рекомби-нантные формы ТБГ, которые имеют свои недо-
статки (структурные отличия, неполный фолдинг, неравноценная посттрансляционная модификация и т.д.). В Лаборатории экологической иммунологии (ФГБУН ИЭГМ УРО РАН, г. Пермь) разработана и запатентована авторская технология выделения и очистки ТБГ [7]. Получаемый препарат максимально близок к составу аутентичного ТБГ, обнаруживаемого в сыворотке беременных. Известно, что in vivo ТБГ представлен целым белковым подсемейством, состоящим из более чем 30 белков, которое в международных базах данных называется PSG (pregnancy-specific glycoprotein) [2]. У человека доминирующим продуктом экспрессии является PSG1, который и был идентифицирован в 1970 г. как ТБГ [8].
Известно, что в формировании иммунной толерантности значимую роль играют Treg [9], осуществляющие супрессорные функции. Кроме того, важную роль играют натуральные киллеры (^Z-клетки) и 7-клетки с функциями натуральных киллеров (^^T-клетки), которые осуществляют цитолиз клеток-мишеней, а также и клетки трофобласта [10]. Помимо этого, формирование периферической толерантности осуществляется благодаря экспрессии антигенпрезентирующими клетками фермента индоламин-2,3-диоксигена-зы (IDO), участвующего в биотрансформации
L-триптофана с образованием токсичных метаболитов [11]. Относительно недавно методами протеомики продемонстрировано, что лишь несколько молекул (из 548, идентифицированных в фетоплацентарной зоне) ингибируют пролиферацию ГГ-лимфоцитов /DO-опосредованным механизмом, среди них — ТБГ, наряду с хориониче-ским гонадотропином, хорионическим сомато-маммотропином и альфа-фетопротеином [12]. В процессе беременности апоптоз необходим для децидуализации маточного эндометрия, инвазии развивающегося эмбриона и обеспечения иммунной толерантности к фетальному трансплантанту. Нарушение апоптоза на системном и локальном уровне отмечается при развитии осложнений беременности.
Целью настоящей работы являлось изучение иммуномодулирующих эффектов ТБГ на экспрессию маркеров NK-, NKT-клеток и Treg, активность /DO моноцитов и апоптоз лимфоцитов человека в системе in vitro.
МЕТОДИКА
ТБГ получали методом хроматографии с использованием биоспецифического сорбента с последующим освобождением от иммуноглобули-новой контаминации на колонке HiTrap™ Proten G HP ("Amersham Biosciences", Швеция) [7]. В качестве биоспецифического сорбента использовали сефарозу CL 4B, гранулы которой конъюгиро-вали с моноклональными антителами к ТБГ, продуцируемыми гибридомой ВАР3 ("Genovac", Германия). Предварительно отцентрифугирован-ную при 25000 g сыворотку крови беременных женщин со сроками беременности свыше 36 недель смешивали с сорбентом и инкубировали в течение 36—48 ч при +4°С. Сорбент переносили в колонку, отмывали фосфатно-солевым буфером с pH 7.25 до нулевых значений оптической плотности. Элюцию осуществляли 0.1 M глицин-HCl буфером с pH 2.6. Фракции, содержащие белок, объединяли и немедленно подвергали концентрирующей диафильтрации против физиологического раствора, после чего проводили негативную хроматографию на колонке HiTrap™ Proten G HP. Содержание ТБГ в препаратах, получаемых в ходе выделения и очистки, определяли при помощи иммуноферментного анализа наборами ТБГ-ИФА-Бест ("Вектор-Бест", Россия). Чистота препарата подтверждалась электрофоретиче-ски, молекулярная гетерогенность — методом LC/MS. Препарат, полученный по этой методике, содержит как минимум 5 молекулярных форм белка: ТБГ-1, ТБГ-3, ТБГ-4, ТБГ-7, ТБГ-9, с преобладанием ТБГ-1. Полученный белок концентрировали до 1 мг/мл.
В работе использовали физиологические концентрации ТБГ, соответствующие его уровню в
периферической крови матери в период беременности — 1, 10 и 100 мкг/мл. Уровень ТБГ в динамике беременности растет с минимальных значений (1—10 мкг/мл) в первые недели, достигая максимума на 33—36 неделе (100 мкг/мл) [1].
В работе использовали фракционированные мононуклеары периферической крови (МПК) практически здоровых доноров, которыми являлись небеременные женщины репродуктивного возраста (n = 21). Учитывая тот факт, что у небеременных женщин определяются небольшие количества ТБГ, причем в лютеиновую фазу уровень этого белка выше [13], в работе использовали клетки, полученные от женщин в фолликулярной фазе. Помимо анамнестических данных, фаза цикла подтверждалась определением в сыворотке крови уровней эстрадиола и прогестерона, имму-ноферментным методом ("Хема", Россия). Исследования проводили согласно Хельсинкской Декларации ВМА 2000 г. и протоколу Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г. Критериями включения явились добровольное согласие на обследование и отсутствие приема гормональных препаратов. МПК получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1.077 г/см3) ("Sigma", США; "Спофа", Чехия, соответственно), после чего клетки отмывали и подвергали воздействию ТБГ (1, 10 и 100 мкг/мл).
После суточной инкубации МПК с ТБГ (полная питательная среда, 5% СО2, 37°С) оценивали фенотип лимфоцитов, определяя содержание NK-клеток с фенотипом CD3CD16+CD56+ и NKT-клеток с фенотипом CD3+CD16+CD56+ (CD3-FITC/CD16.56-PE), согласно методике производителя антител ("Beckman Coulter", США).
Для оценки уровня Treg МПК культивировали с ТБГ в аналогичных условиях в течение суток. Поскольку экспрессия транскрипционного фактора FOXP3 является основным маркером Treg, с помощью внутриклеточного окрашивания моно-клональными антителами в гейте лимфоцитов определяли экспрессию FOXP3 в гейте CD^-лим-фоцитов (CD4-PE/FOXP3-FITC; "BioLegend", США) и в гейте CD4+CD25bright лимфоцитов (CD4-P. Cy 5/CD25-PE/FOXP3-Alexa Fluor®488; "BioLegend", США). Фиксацию и пермеабилиза-цию осуществляли при помощи буферов "BioLegend" (США) согласно методике. Результаты учитывали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur ("Becton Dickinson", США).
Активность IDO определяли спектрофотомет-рически по изменению концентрации кинурени-на [14]. Учитывая, что IDO продуцируется только антиген-презентирующими клетками, которые в МПК представлены моноцитами, полученные результаты интерпретировали как продукцию IDO моноцитами. МПК, после часовой инкуба-
Таблица 1. Влияние ТБГ на экспрессию CD16/56 NK- и NKT-клетками (n = 7)
Экспериментальное воздействие NK-клетки CD3~CD16+CD56+ NKT-клетки CD3+CD16+CD56+
Контроль 8.27 ± 0.93 0.768 ± 0.156
ТБГ (1 мкг/мл) 6.25 ± 1.11 0.977 ± 0.207
ТБГ (10 мкг/мл) 6.71 ± 0.94 1.257 ± 0.132*
ТБГ (100 мкг/мл) 4.95 ± 0.54* 1.320 ± 0.154*
Примечание: Здесь и в табл. 2 и 3: * — достоверные (р < 0.05) различия по парному ¿-критерию Стьюдента с контролем.
ции с ТБГ, культивировали в растворе Хенкса (4 ч), содержащем 100 мкМ триптофана ("Sigma", США), в спонтанном и липополисахарид (ЛПС)-индуцированном варианте теста. Затем к 100 мкл клеточного супернатанта добавляли 50 мкл 30% трихлоруксусной кислоты, встряхивали на вортексе и центрифугировали в течение 5 мин. После этого в лунки 96-луночного планшета вносили 75 мкл супернатанта, смешивали с равным объемом реактива Эрлиха. Для определения концентрации кинуренина строили калибровочную кривую с известным содержанием кинуренина ("Sigma", США). Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на многоканальном спектрофотометре Biohit BP 800 ("Bio-Tek Instrumens, Inc.", США).
Апоптоз лимфоцитов оценивали путем окрашивания аннексином-V (AnV-FITC) и йодистым пропидием (PI). Данный метод позволяет идентифицировать клетки, находящиеся в ранней (AnV+/P
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.