МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 350-357
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.841.31.017.73:577.114.7
изучение липополисахаридов Бтокнповтм МБЫЬОП
СХМ1-188 и двух его МУТАНТОВ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИХСЯ
сниженной нодуляционной конкурентоспособностью
© 2004 г. Л. В. Косенко*' Т. В. Затовская*' **
*Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев **Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии
РАСХН, С.-Петербург-Пушкин Поступила в редакцию 28.10.02 г.
Проведено сравнительное изучение липополисахаридов (ЛПС), выделенных из Б1погЫ2оЪшт теШо-и СХМ1-188 и двух его ЛПС-мутантов (ТЬ29 и Т$22) с резко сниженной нодуляционной конкурентоспособностью. При электрофорезе ЛПС и полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия у всех трех штаммов было обнаружено две зоны: ЛПС1 - формы, содержащей О-полисаха-рид (О-ПС), и более низкомолекулярного ЛПС2, не содержащего О-ПС. Однако у мутантов зона ЛПС1 была выражена значительно меньше, чем у родительского штамма. ЛПС изучаемых штаммов содержали глюкозу, галактозу, маннозу, ксилозу, три неидентифицированных сахара: Х1 (Т01с 0.53), Х2 (Т01с 0.47) и Х3 (Т01с 0.43), глюкозамин и этаноламин, а ЛПС 5. теШой СХМ2-188, кроме того, - галактозамин, глюкуроновую и галактуроновую кислоты и 2-кето-3-дезоксиоктулозоновую кислоту (КДО), а также такие жирные кислоты: 3-ОН С14 : 0, 3-ОН С15 : 0, 3-ОН С16 : 0, 3-ОН С18 : 0, не-идентифицированную оксиХ (Т3-ОН С14 : 0 1.33), С18 : 0 и ненасыщенную С18 : 1 жирные кислоты. Будучи сходными по составу компонентов, ЛПС мутантов отличались от ЛПС родительского штамма меньшим относительным содержанием сахаров Х2 и Х3, 3-ОН С14 : 0 и большим - КДО, С18 : 0 и оксиХ. ЛПС всех трех штаммов подвергали мягкой деградации 1%-ной уксусной кислотой и фракционировали на колонкбе с Sephadex 0-25. Более высокомолекулярные фракции (2500-4000 Да) содержали набор сахаров, характерный для недеградированного ЛПС и соответствовали, вероятно, полисахаридной части ЛПС1 (ПС1). Во фракциях с меньшей молекулярной массой (600-770 Да, ПС2) основными по содержанию компонентами были глюкоза и уроновые кислоты; в меньших количествах в них присутствовали галактоза, манноза и Х1. Соотношение ПС1/ПС2 для обоих мутантов было значительно меньшим, чем для штамма СХМ1-188. Полученные данные указывают на то, что в гетерогенном липополисахаридном комплексе мутантов имеется меньшее, чем в ЛПС СХМ1-188, количество О-ПС-содержащих молекул (ЛПС1), что повышает гидрофобность клеточной поверхности мутантных бактерий. Предполагается, что это способствует их неспецифической адгезии на корнях растения-хозяина и таким образом снижает их нодуляционную конкурентоспособность.
Ключевые слова: БтогНкоЪшт теШой, бобово-ризобиальный симбиоз, липополисахарид, нодуля-ционная конкурентоспособность.
В сложном и многоэтапном процессе образования бобово-ризобиального симбиоза бактериальные гликополимеры, в частности липополиса-хариды (ЛПС), играют важную роль [1]. Являясь компонентом регуляторного механизма лекти-нуглеводного узнавания, они определяют специфичность, а значит, и эффективность азотфиксиру-ющей симбиотрофной системы. Помимо выполнения разнообразных биоэффекторных функций, липополисахариды, благодаря наличию в их составе липидной части, вносят свой вклад в гидрофобность клеточной поверхности бактерий. Это оказывает влияние на неспецифическую адгезию ризобий на растениях, поскольку поверхность раститель-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: varbanets@imv.kiev.ua).
ных клеток также гидрофобна. Поэтому от физико-химических особенностей и макроструктур-ной организации ЛПС могут зависеть не только совместимость ризобий с растением-хозяином, но и их инфекционные свойства - вирулентность и конкурентоспособность [2, 3].
Мезштаммовая борьба ризобий за образование клубеньков на корнях бобовых растений, называемая нодуляционной конкурентоспособностью, так же, как специфичность и вирулентность, служит фактором сохранения штаммовой специализации клубеньковых бактерий в отношении того или иного растения-хозяина. С другой стороны, от нодуляционной конкурентоспособности интроду-цируемых штаммов в составе бактериальных удобрений зависит их успех в борьбе с аборигенной
микрофлорой за образование корневых клубеньков на растении-хозяине, что в конечном итоге обусловливает целесообразность их использования.
Ранее нами на основе штамма БтогНкоЪшт твШой СХМ1-188 были получены Тп5-мутанты (ТЬ29 и Тв22), синтезирующие, судя по данным электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, модифицированный ЛПС. Оба штамма не изменили своей эффективности и азотфиксирующей активности, но резко снизились конкурентоспособность [4, 5].
Нами было установлено, что в геноме каждого из мутантов присутствует единственная инсерция транспозона Тп5 [5]. Таким образом, единичное повреждение одного из многочисленных генов, вовлеченных в синтез ЛПС, опосредованно вызвало снижение конкурентоспособности ризобий, что указывает на зависимость их симбиотическо-го статуса от свойств их ЛПС.
В связи с этим целью настоящей работы было сравнительное изучение и выявление различий между липополисахаридами родительского штамма Б. твШой и двух его ЛпС-мутантов, характеризующихся резко сниженной нодуляционной конкурентоспособностью.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактерии. В работе использовали три штамма ЗтогЫхоЪшт (ранее КЫхоЪшт) твШой (клубеньковые бактерии люцерны): штамм СХМ1-188 (коллекция ЯЫхоЪшт Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии, С.-Петербург-Пушкин) и два его Тп5-индуцированных мутанта: ТЬ29 и Тв22 [4]. Бактерии выращивали в жидкой среде, содержащей пептон (10 г/л), дрожжевой экстракт (1 г/л), СаС12 (0.2 г/л), при 28-30°С в течение 24 ч.
Получение ЛПС. Клетки бактерий осаждали центрифугированием при 5500 g 40 мин, промывали 4 раз физиологическим раствором, сушили с помощью ацетона и эфира. ЛПС экстрагировали из сухих клеток ризобий 45%-ной водно-феноль-ной смесью согласно методике Westpha1, 1апп [6]. Для удаления кислых экзогликанов и нуклеиновых кислот ЛПС обрабатывали 2%-ным цетавло-ном в 0.5 М растворе КаС1. Смесь центрифугировали при 5500 g, 30 мин. ЛПС осаждали из супернатан-та 10-кратным объемом этанола и диализировали против дистиллированной воды. Для очистки от периплазматического глюкана, с которым, как правило, связаны ризобиальные ЛПС, проводили ультрацентрифугирование при 105000 g (3 раза по 5 ч). ЛПС (осадок) сушили лиофильно.
Электрофорез в полиакриламидном геле с до-децилсульфатом натрия проводили по стандартной методике [7]. Анализу подвергали как сырые
клетки, обработанные протеиназой К, как описано ранее в [4], так и изолированные препараты ЛПС. Гели окрашивали нитратом серебра и алци-аном голубым.
Частичная деградация ЛПС. Мягкий кислотный гидролиз ЛПС проводили с помощью 1%-ной уксусной кислоты (4 ч, 100°C). Полисахаридную часть (ПС) отделяли от липида А центрифугированием при 5500 g, 30 мин.
Липид А (осадок) промывали последовательно 0.01 М HCl, метанолом и ацетоном для очистки от сопутствующих фосфолипидов. ПС (супернатант) центрифугировали при 25000 g для осаждения недеградированных остатков ЛПС. Сушили лиофильно.
Фракционирование ПС проводили на колонке (55.4 х 2.1 см), заполненной Sephadex G-25 ("Pharmacia") и уравновешенной пиридин-ацетатным буфером, рН 4.5. Объем фракций - 3.0 мл, скорость протекания буфера - 0.3 мл/мин. Элюцион-ные профили выхода фракций с колонки строили по содержанию в них общих углеводов, уроновых кислот и КДО. Для калибровки колонки и определения молекулярной массы (ММ) полисахаридных фракций ЛПС использовали стандарты углеводной природы: глюкозу (180 Да), маннозу (180 Да), глю-когептозу (210 Да), трегалозу (342 Да), рафинозу ■ ■ 5H2O (594 Да), стахиозу (666 Да), Декстран синий (2 млн. Да) - фирмы "Sigma", Декстран-10 (9800 Да) - фирмы "Pharmacia". Молекулярную массу рассчитывали согласно Детерман [8], исходя из линейной зависимости отношения ve/v0 от
lg MM, где ve - объем выхода фракций с колонки, v0 - холостой объем геля.
Изучение компонентного состава. Для определения нейтральных углеводов проводили предварительный гидролиз препаратов ЛПС 2 N HCl в запаянных ампулах (6 ч, 100°C). Полученные гид-ролизаты анализировали методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) на хроматографе Хром-5 (Чехословакия) с пламенно-ионизационным детектором. Колонка (120 х 0.3 см) с неподвижной фазой - SP 2340 на Хроматроне (100 меш). Температура термостата - 170-230°C со скоростью повышения испарителя - 240°C. Расход гелия и водорода - 30 см3/мин, воздуха - 300 см3/мин. Идентификацию сахаров проводили по времени удерживания (7) их ацетатов полиолов и сравнением с соответствующими стандартами. Для не-идентифицированных сахаров устанавливали их время удерживания по отношению к таковому глюкозы (Tglc). Относительное содержание каждого компонента рассчитывали по площадям пиков ацетатов полиолов на ГЖХ-хроматограммах.
Жирные кислоты определяли после метаноли-за препаратов ЛПС безводным раствором 2 N HCl в метаноле в запаянных ампулах (4 ч, 100°C). Метиловые эфиры жирных кислот экстрагировали из реакционной смеси гексаном (3 раза по 3 мл)
(а)
ЛПС1
• *
CXM1-188 Tb29
ЛПС2
Ts22 CXM1-188
(б)
щ i p
« я 1
• т • •;
CXM1-188 Tb29 Ts22 CXM1-188
ЛПС1
ЛПС2
Рис. 1. Электрофорез в полиакриламидном геле ЛПС S. meliloti СХМ1-188 и двух его Гя5-индуцированных мутантов: Tb29 и Ts22. Окрашивание гелей: а - нитратом серебра; б - последовательная обработка алциа-ном голубым и нитратом серебра.
и определяли методом ГЖХ на хроматографе Хром-5 (Чехословакия) с использованием двух колонок. Одна (120 х 0.3 см), заполненная 5% SE-30 на Хроматоне N-AW-DMCS ("Lachema", Чехословакия) с режимом работы 125-250°C, 3°С/мин. Другая колонка (200 х 0.3 см) с 5% DEGS на Supelco-port (100-120 меш) (Supelco SA, Switzerland) при 200°C. Газ-носитель - гелий. Идентификацию жирных кислот проводили по их времени удерживания на колонке и сравнением со стандартами. Для идентификаци
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.