БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 6, с. 488-498
УДК 577.352.2
ИЗУЧЕНИЕ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ БЕЛКОВ М1
ВИРУСА ГРИППА НА ПОВЕРХНОСТИ МОДЕЛЬНОЙ ЛИПИДНОЙ МЕМБРАНЫ МЕТОДОМ КОМПЕНСАЦИИ ВНУТРИМЕМБРАННОГО ПОЛЯ
© 2008 г. Д. Г. Князев, В. Ä. Радшхин*, В. С. Соколов
Институт физической химии и электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН, 119991 Москва, Ленинский просп., 31,
электронная почта: enchden@elchem.ac.ru *Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва Поступила в редакцию 21.07.2008 г.
Связывание матриксного белка М1 с бислойной липидной мембраной (БЛМ) регистрировалось по изменению граничного потенциала методом компенсации внутримембранного поля. Адсорбция белка на мембране после его введения в водный раствор приводила к медленному увеличению граничного потенциала до достижения стационарного значения за время, зависящее от количества добавленного белка. Стационарное значение потенциала возрастало при понижении рН раствора, концентрации KCl, а также при введении в состав БЛМ отрицательно заряженных липидов. Показано, что возрастание потенциала при понижении рН вызвано увеличением заряда молекул М1, а не их поверхностной концентрации и не изменением заряда липидов. На основании того, что потенциал не уменьшался при удалении белка из раствора, сделан вывод о необратимости связывания М1 на поверхности мембраны. Полученные результаты объясняются тем, что на адсорбцию белка влияют как электростатические, так и гидрофобные взаимодействия молекул М1 между собой и с липидной мембраной. Предложен механизм диссоциации белкового каркаса, образуемого М1 в вири-оне, при понижении рН, согласно которому каркас дестабилизируется из-за электростатического отталкивания молекул белка, вызванного увеличением их положительного заряда.
Матриксный М1 белок вируса гриппа, наиболее представленный среди белков вириона, является мембранно-ассоциированным. Он образует каркас, располагающийся под липидным бислоем (рис.1), который формирует структуру и обеспечивает механическую прочность вирионов. Внутри белкового каркаса находится генетический материал вируса - 8 однонитевых молекул РНК, существующих в комплексе с нуклеобелками, которые образуют ри-бонуклеопротеиновые сегменты (РНП). Белок М1 является ключевым элементом, опосредующим многие процессы взаимодействия между вирусом и клеткой, причем основополагающим является взаимодействие белка с бислойными липидными структурами [1]. К настоящему времени известно, что этот белок представляет собой небольшую (27.8 кДа, 252 аминокислотных остатка) молекулу, плотно прилегающую к внутренней стороне вирусной мембраны [2]. На этапе образования новых вирусных частиц - баддинге - белок М1 необходим для формирования жизнеспособного вириона. Соотношение количества молекул М1 и РНП частиц в процессе сборки связано с морфологией и инфекционной способностью новообразованных вирионов [3]. Взаимодействие белка М1 с липидными мембранами было продемонстрировано в ряде ра-
бот [1, 4]. На примере матриксного белка вируса везикулярного стоматита было показано, что этот белок стремится деформировать липидную поверхность, создавая структуры со сферической геометрией [5]. Именно эти свойства матриксного белка, как полагают, определяют его роль в процессе отпочковывания от клеточной мембраны новых вирионов, синтезированных в зараженной клетке.
Согласно данным, полученным методами малоуглового нейтронного рассеяния, кругового дихроизма и электронной микроскопии [6, 7], мономер М1 представляет собой удлиненную молекулу. Образуемый такими молекулами в вирионе каркас имеет толщину около 60А, а размер ячейки около 40А [1]. Вопрос о том, что представляет собой белок М1 в выделенном состоянии в водном растворе, до настоящего времени остается открытым. В работе [8] говорится, что М1 в водном растворе представляет собой димер, тогда как в работе [6] утверждается, что как при низком, так и при нейтральном рН М1 находится в виде мономера. Структуру этого белка подразделяют на три части: К-концевую (К-домен), среднюю (М-домен) и С-концевую (С-домен). И если структура К-конце-вого фрагмента белка М1 (аминокислотные остатки
2-158, М- и К- домены) была успешно определена рентгеноструктурным анализом [8, 9], то структура С-концевой части (и соответственно молекулы М1 в целом) до сих пор не установлена. Причиной этого является необычайно высокая лабильность петли, соединяющей М-К-домены и С-домен, что приводит к фрагментации полноразмерного белка в этом месте при кристаллизации. Пространственная же структура белка М1 в мембранном окружении - это отдельный вопрос, на который еще предстоит ответить. Продолжается активная дискуссия о характере М1-М1 взаимодействий в составе мат-рикса и взаимодействий белка М1 с вирусной мембраной т 81Ы [6, 10, 11]. Показано [1, 12], что важную роль при связывании белка с липидной мембраной играет электростатическое взаимодействие положительно заряженных аминокислот М1 с отрицательно заряженными группами мембранных липидов. В работе [8] предложена гипотеза о гидрофобных взаимодействиях К-концевого домена белка М1 и вирусной липидной мембраны.
Относительный вклад электростатических и гидрофобных сил, отвечающих за эти взаимодействия, представляет особый интерес, и их изучению посвящена данная работа. Мы исследовали влияние на адсорбцию белка М1 электростатических взаимодействий белков между собой и с липидной мембраной. С этой целью варьировались поверхностный заряд мембраны за счет изменения содержания в ней заряженных липидов, рН раствора и его ионная сила. Связывание белка с липидной оболочкой мы изучали на модельной системе -бислойной липидной мембране (БЛМ). Для регистрации адсорбции белка был использован метод компенсации внутримембранного поля (КВП), измеряющий разность граничных потенциалов БЛМ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В экспериментах были использованы реактивы: KCl ("Sigma", США), HEPES ("Calbiochem", США), MES ("Calbiochem"), цитрат натрия (ос.ч., "Реахим", Россия), EDTA ("Life Technologies", США), KOH (х.ч., Реахим, Россия), HCl (х.ч., Реахим, Россия), агар-агар ("Sigma"), липиды дифита-ноилфосфатидилхолин (ДФФХ) и дифитаноил-фосфатидилсерин (ДФФС) ("Avanti Polar Lipids", США).
Матриксный белок М1 был выделен из вирио-нов гриппа штамма A/PR/8/34 методом Жирнова [13]. Чистота полученного белка в исходном растворе (100 мМ KCl, 50 мМ MES, рН 3.5) проверялась электрофорезом в полиакриламидном геле. Этот раствор затем добавлялся в экспериментальную ячейку с БЛМ. Концентрация белка в этом
Рис. 1. Схематическое изображение вируса гриппа. ГА - гемагглютинин, Н - нейраминидаза, М2 - протонный канал, М1 - матриксный белок. Адаптировано из [2].
растворе определялась количественным аминокислотным анализом и составляла примерно 18 мкМ. Аминокислотный анализ осуществлялся на анализаторе Hitachi L-8800 (Япония) в стандартном режиме разделения на катионобменной колонке с детекцией нингидриновым реагентом. Для предотвращения агрегации белка М1 его концентрация в ячейке не превышала 1/300 мкг/мкл.
Состав использованных буферных растворов различался в разных экспериментах и указан в подписях к рисункам. Буферные растворы содержали KCl в требуемой концентрации (в основном -10 мМ, реже - 100 мМ); 2 мМ HEPES (при рН 7.0), 2 мМ MES или 2 мМ цитрат (при рН 5.0 и 6.0). В экспериментах с низкой ионной силой (10 мМ KCl) в раствор для удаления примесных многовалентных ионов добавляли 0.1 мМ EDTA. Плоские БЛМ формировали из ДФФХ и ДФФС или из их смеси в мольном отношении 7:3 соответственно.
Электрические измерения проводили с помощью хлорсеребряных электродов, которые контактировали с растворами в ячейке через солевые мостики, изготовленные из наконечников для микропипеток. Нижнюю часть наконечника заполняли агар-агаром, приготовленным в 0.1 М Kd, а сверху наливали раствор 0.1 М KCl, в который погружали электрод. Сопротивление электродов с мостиками составляло не более 40-50 кОм.
Бислойные липидные мембраны формировали методом Мюллера-Рудина из растворов фосфоли-
Рис. 2. Изменение граничного потенциала при введении Ml-белка в разной концентрации в начальный момент времени с ^ис-стороны БЛЫ, сформированной из смеси 70% ДФФХ и 30% ДФФС. Состав буферного раствора: 10 мЫ KCl, 0.1 мЫ EDTA, 2 мЫ MES, pH 5.0. Концентрация добавленного белка в ячейке 50 (1), 100 (2) и 200 нM (3).
пидов в декане (в концентрации 15 мг/мл) на отверстии диаметром 1 мм в перегородке тефлоновой ячейки с объемом отсека 300 мкл. Для контроля формирования мембраны измеряли ее электрическую емкость. К одному электроду подключали генератор переменного напряжения, а ко второму -усилитель тока (Keithley-427, США), выход которого был связан с платой АЦП (L78G, Loará, Россия) в компьютере. Значение емкости определяли при помощи программы, разработанной авторами. О том, что удалось сформировать бислойную мембрану, свидетельствовало появление емкости 1-2 нФ.
Разность граничных потенциалов БЛM измеряли методом компенсации внутримембранного поля с использованием второй гармоники емкостного тока [14]. Mетoд основан на способности мембран сжиматься в электрическом поле, вследствие чего их емкость зависит от напряжения. Mини-мальное значение емкости достигается при напряжении, равным разности граничных потенциалов БЛM, поскольку именно это напряжение компенсирует внутримембранное электрическое поле. Спряжение, соответствующее минимуму емкости, измерялось как постоянная составляющая подаваемого на мембрану напряжения, при которой вторая гармоника емкостного тока обращалась в нуль. Измерение осуществлялось с помощью автоматической установки с использованием фазочув-ствительного усилителя DSP-7265 ("Signal Recovery", США), который управлялся компьютером
через приборный интерфейс GPIB ("Measurement Computing", США) с помощью разработанной авторами программы. К мембране прикладывали сумму синусоидального (с выхода генератора Г3-118, Россия) и постоянного (с выхода DSP-7265) напряжений. Напряжение с выхода усилителя (Keithley-427), пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.