ГЕНЕТИКА, 2Ü15, том 51, № 7, с. 759-765
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 575.2:577.29
ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПОПУЛЯЦИЙ ДИКОЙ ЯБЛОНИ Malus sieversii ЗАИЛИЙСКОГО АЛАТАУ С ПОМОЩЬЮ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ
© 2015 г. М. Е. Омашева1, С. В. Чекалин2, Н. Н. Галиакпаров1
Институт биологии и биотехнологии растений, 050040Алматы, Казахстан e-mail: madison_best@mail.ru 2Институт ботаники и фитоинтродукции, 050040 Алматы, Казахстан e-mail: botanyphyto@mail.ru Поступила в редакцию 24.07.2014 г.
Территория Казахстана входит в ареал распространения Malus sieversii, являющейся одним из предков культурных сортов яблонь. Собранные образцы листьев яблони Сиверса пяти популяций региона Заилийского Алатау послужили источником не только создания банка геномной ДНК, но и определения генетического полиморфизма дикой яблони. Использованные семь микросателлит-ных маркеров позволили выявить 86 аллелей с разной частотой встречаемости, а также характерный пул редких аллелей для каждой из популяций. Проведенный молекулярно-генетический анализ показал высокий уровень генетического разнообразия (Ho = 0.704, PIC = 0.752, I = 1.617). При этом на межпопуляционную изменчивость приходится только 7.5%, что подтверждает генетическую близость исследованных популяций. На основании филогенетического анализа оказалось, что наиболее близкими являются популяции Бельбулак и Алматинский заповедник, а наиболее отдаленными — Кетмень и Большое Алматинское ущелье, что свидетельствует о зависимости генетического расстояния от географического.
DOI: 10.7868/S0016675815070103
Согласно Н.И. Вавилову [1], одним из центров происхождения дикой яблони является территория Казахстана. Во "Флоре Казахстана" были описаны несколько видов рода Malus [2]. Одним из наиболее значимых является Malus sieversii, признанный родоначальником и подвоем для культурных сортов Malus domestica Borkh [3]. Яблоня Сиверса вместе с яблоней M. niedzwetzkyana занесены в Красную книгу Казахстана. Тем не менее до сих пор в отношении видовой принадлежности диких яблонь Казахстана мнения систематиков различаются. А.Д. Джангалиев [4] признает наличие трех видов: Malus sieversii, Malus kir-ghisorum, Malus niedzwetzkyana. С.А. Абдулина [5] считает, что реальны только два вида — M. sieversii и M. niedzwetzkyana. Также молекулярно-генети-ческими исследованиями было показано, что Malus niedzwetzkyana является родственной, но не идентичной M. sieversii и генетически более удалена от сортов яблони домашней [6].
Предположения о том, что в природных популяциях яблони Центральной Азии представлены "дикие" виды и "одичавший" сортовой материал и гибриды между ними, высказывали еще М.Г. Попов [7] и Е.П. Коровин [8]. Очевидна необходимость молекулярно-генетической характеристики видового состава дикой яблони Казахстана. Эта необходимость обусловлена фунда-
ментальными и практическими аспектами, поскольку признание значимости и целесообразности охраны генофонда дикой яблони требует определения и обоснования "предмета" охраны.
Еще Н.И. Вавилов говорил о важности изучения диких видов, о необходимости изучения фи-логенетики культурных растений и их взаимоотношений с дикими сородичами с использованием современных генетических знаний [1]. В процессе повышения продуктивности культурными растениями утрачиваются определенные важные признаки например такие, как устойчивость к стрессовым факторам среды. Генетически однородные сорта замещают генетически более разнообразные, что приводит к потере генов диких сородичей, в первую очередь устойчивости к вредителям и патогенам и адаптивности к меняющимся климатическим факторам. Очевидно, что популяции диких яблонь на территории Казахстана являются незаменимыми донорами генов устойчивости к стрессовым факторам, которые были утрачены культурными сортами [9].
Для экологической пластичности популяций огромное значение имеет поддержание генетического разнообразия. Наличие в популяции нескольких аллелей по определенным локусам позволяет самой популяции адаптироваться к варьирующим условиям среды [10]. Антропогенное
Рис. 1. Карта расположения исследуемых популяций дикой яблони в Заилийском Алатау (1 — Большое Алматинское ущелье; 2 — Бельбулак; 3 — Алматинский заповедник (правый Талгар); 4 — Тау Тургень (Кузнецова щель); 5 — Кетмень).
воздействие приводит к драматическому сокращению ареала распространения дикой яблони в горных районах Центральной Азии. Закладка садов культурных сортов вблизи лесов дикой яблони приводит к генетической эрозии природных популяций, тем самым нарушает биоразнообразие. Молекулярно-генетическая систематика и организация охраны природного генофонда обеспечат сохранение гермоплазмы диких яблонь и развитие на этой основе селекционных программ по улучшению генофонда культурной яблони.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительным материалом для работы послужили пять популяций дикой яблони Заилийского Алатау. Собраны листья 180 образцов, из них: 40 образцов популяции Тау Тургень (Кузнецова щель), 48 образцов популяции Алматинский заповедник (правый Талгар), 36 образцов популяции ущелья Бельбулак, 48 образцов популяции Большое Алматинское ущелье и 8 образцов популяции Кетмень (рис. 1). Для каждой из пяти популяций диких яблонь Заилийского Алатау с помощью GPS навигационной системы был составлен план расположения каждого дерева, с которого были взяты листья. Листья были собраны с деревьев различного возраста: от менее 10 лет и до более 140 лет.
Собранные листья сохранены при —80° до последующего выделения из них геномной ДНК.
Выделение ДНК. Геномную ДНК выделяли согласно процедуре, описанной ранее [11]. Анализ качества и количества выделенной ДНК проводили в 1%-ном агарозном геле, а также с использованием спектрофотометрии. Чистоту полученных препаратов ДНК определяли отношением поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (A260/280). Использовали для анализов ДНК с соотношением от 1.7 до 1.9.
SSR анализ. Для характеристики генетического разнообразия использованы семь микросател-литных маркеров, ранее уже использованных в исследованиях по генотипированию яблони [12]. Также использованы три неспецифических оли-гонуклеотида, меченных различными флуоресцентными красителями. Нуклеотидные последовательности этих олигонуклеотидов добавлены на 5'-конец одного из праймеров каждого маркера. Данная модификация позволила снизить стоимость SSR анализа [13].
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в два этапа. Первичная ПЦР в объеме 20 мкл содержала 2 мкл 10х Taq буфера (750 мМ Tris HCl, pH 8.8, 200 мМ (NH4)2SO4, 0.1% Tween 20), 2.5 мМ MgCl2, 0.2 мМ каждого дезоксинуклеоти-дтрифосфата (dNTP), 1 ед. Taq-полимеразы и 40 нг ДНК. Амплификацию проводили в следующем температурном режиме: один цикл 2 мин при
Таблица 1. Значения основных показателей генетического разнообразия для пяти популяций Заилийского Алатау по микросателлитным локусам
Локус Na Ne Ho He PIC PI I
GD12 11 5.030 0.795 0.800 0.804 0.052 1.755
GD96 15 4.327 0.698 0.762 0.784 0.058 1.718
GD142 15 6.230 0.872 0.832 0.845 0.033 2.034
GD147 13 4.189 0.595 0.755 0.791 0.059 1.603
GD162 18 4.190 0.651 0.714 0.760 0.065 1.713
GD100 6 2.911 0.425 0.644 0.631 0.156 1.132
GD103 8 3.140 0.887 0.679 0.650 0.135 1.368
Среднее значение 12.285 4.288 0.704 0.741 0.752 - 1.617
SE 0.486 0.244 0.030 0.014 - - 0.058
Примечание. Na — количество аллелей на локус, Ne — эффективное количество аллелей на локус, Ho — наблюдаемая гетеро-зиготность, He — ожидаемая гетерозиготность, PIC — индекс информативности маркера, PI — вероятность идентичности, I — информационный индекс Шеннона, SE — стандартная ошибка среднего.
94°C; семь циклов, состоящих из следующих ступеней — 1 мин при 94°C, 2 мин при 56°C и 2 мин при 72°C; 20 циклов — 1 мин при 94°C, 2 мин при 53—51°C и 2 мин при 72°C; и в заключение один цикл 10 мин при 72°C. По завершении ПЦР 10 мкл каждой реакции проверяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Остаток ПЦР разбавляли в 10 раз водой и 1 мкл использовали для вторичной ПЦР. Состав реакции вторичной ПЦР идентичен первичному, за исключением прямых олигонуклеотидов, вместо которых были использованы флуоресцентно-меченные "хвосты". Программа амплификации для вторичной ПЦР была идентична первичной, при этом продолжительность последней стадии элонгации при 72°C была увеличена с 10 до 30 мин.
ПЦР-продукты семи маркеров одного образца объединялись с добавлением формамида и стандарта размеров, меченного красителем LIZ (Size standard 500 LIZ, Applied Biosystems); общий объем смеси составлял 10 мкл, в котором продукты ПЦР, проведенные с олигонуклеотидами, меченными красителем VIC, разбавлены в 540 раз, NED — в 120 раз и 6-FAM — 360 раз с целью выравнивания уровня сигнала.
Фрагментный анализ проводили с помощью капиллярного электрофореза на анализаторе ABI Prism 310 (Applied Biosystems). Полученные результаты обрабатывали с помощью программы GeneMapper 4.0.
Статистическая обработка данных. Размеры аллелей, определенные программой GeneMapper 4.0, были конвертированы и занесены в MS Excel 2007. В качестве референса использован сорт Голден Делишес, с помощью которого точные размеры
откорректированы программой TANDEM v. 1.09
[14].
С помощью программного обеспечения GenAlex6.5 [15] определены частота и число аллелей, среднее количество аллелей на локус (Na), число эффективных аллелей (Ne), количество и частота редких аллелей для каждой популяции, индекс Шеннона, /-статистика и тест Мантеля. Ожидаемая и наблюдаемая гетерозиготность, индекс информативности маркера (PIC) были вычислены с помощью макроса Excel Microsatellite Tool Kit.
Дендрограмма построена с помощью программы Tree Figure Drawing Tool v. 1.4 методом UPGMA на основании генетического расстояния по Нею [16].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Семь пар праймеров, использованных в генетическом анализе популяций дикой яблони, показали 100%-ную полиморфность. Количество аллелей для всех локусов варьировало от 18 для GD162 до 6 для GD100, при этом среднее значение количества аллелей на локус составило 12.285 (табл. 1). Наиболее часто встречающиеся аллели всех семи локу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.