МЕТОДИКА ЗООЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
УДК 593.13:591.471.1
ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ ЦЕНТРОХЕЛИДНЫХ СОЛНЕЧНИКОВ МЕТОДОМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
© 2013 г. А. О. Плотников12, Е. А. Ермоленко2, А. Н. Никиян2, А. С. Васильченко12
1 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН, Оренбург 460000, Россия 2Оренбургский государственный университет, Оренбург 460018, Россия e-mail: protoz@mail.ru Поступила в редакцию 01.08.2012 г.
Впервые использован метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) для морфологической оценки структурных элементов перипласта центрохелидных солнечников и их видовой идентификации. Применение этого метода позволило детально исследовать морфологические и морфометрические характеристики чешуек представителей трех семейств центрохелидных солнечников — Heterophrys marina (Heterophryidae), Polyplacocystis ambigua (Raphidiophryidae) и Raineriophrys erinaceoides (Acan-thocystidae). С помощью АСМ можно определять морфометрические характеристики чешуек цен-трохелид, визуализировать поверхностные структуры клетки и получать трехмерные изображения элементов перипласта. Данный вид микроскопии может применяться для изучения морфологии центрохелид и представителей других таксонов протистов, имеющих наружный органический или минеральный скелет, в качестве метода, альтернативного методу сканирующей электронной микроскопии.
Ключевые слова: Heliozoa, Centrohelida, атомно-силовая микроскопия. DOI: 10.7868/S0044513413060123
Центрохелиды, или центрохелидные солнечники (Centroheliozoa Durrschmidt et Patterson 1987), представляют собой монофилетический таксон одноклеточных амебоидных протистов, объединяющий на данный момент около 100 видов. Представители центрохелид характеризуются консерватизмом внутренней организации и объединены наличием мощной радиальной системы расходящихся лучей — аксоподий, которые снабжены стрекательными органеллами — экс-трусомами, служащими для заякоривания и удержания мелкой подвижной пищи. Представители этого таксона солнечников отличаются выраженным разнообразием структурных элементов клеточной оболочки — перипласта, представляющих собой кремниевые овоидные чешуйки и трубчатые спикулы. Форма и размер чешуек и спикул имеют ведущее значение в таксономии центрохе-лид и их идентификации (Микрюков, 1998, 2002; Siemensma, 1991).
На данный момент разработана систематика центрохелидных солнечников, основанная на морфологических признаках элементов перипласта. Отряд Centrohelida включает 15 родов, объединенных в три семейства, и насчитывает более 100 видов (Микрюков, 2002; Леонов, 2012). Филогенетическое положение центрохелид в настоящее время остается неясным. Применение с этой целью последовательности гена 18S рРНК
приводит к расположению центрохелид на филогенетическом древе эукариот в качестве сестринского таксона гаптофитовых водорослей (Cavalier-Smith, von der Heyden, 2007). Использование генов а-тубулина, Р-тубулина и актина помещает центрохелид в один кластер с Rhodophyta (Sak-aguchi et al., 2005), а применение мультигенного анализа с добавлением к уже упомянутым генов, кодирующих фактор элонгации EF2, и белки теплового шока HSP70 и HSP90 приводит к противоречивым результатам и не позволяет однозначно определить филогенетическое положение этих организмов (Sakaguchi et al., 2007). Таким образом, несмотря на тщательную изученность ультраструктуры центрохелид, данные молекулярной филогении в совокупности с пластинчатой формой митохондриальных крист и отсутствием жгутиковой стадии в жизненном цикле сохраняют за центрохелидами статус таксона incertae sedis в системе эукариот.
Микроскопические методы являются основными для изучения морфологии центрохелид. Традиционно в исследованиях этой группы протистов применяются световая, электронная сканирующая и электронная трансмиссионная микроскопия (Zlatogursky, 2010; Леонов, Плотников, 2009; Леонов, 2010, 2012; Микрюков 1995, 1997, 1998, 2002; Bardele 1975, 1977; Durrschmidt, Patterson, 1987, 1987a; Siemensma, 1991; Wujek, 2003,
955
6*
2006). Наиболее широкое распространение получили методы электронной микроскопии, которые позволяют определять морфологию кремниевых чешуек.
Атомно-силовая микроскопия (АСМ), представляющая собой один из методов сканирующей зондовой микроскопии, редко применяется при изучении одноклеточных эукариот. С помощью АСМ изучена морфология некоторых представителей протистов: диатомей Eunotica sudetica, Nav-iculapelliculosa и N. seminulum (Almqvist et al., 2001; Gebeshuber et al., 2003), паразитических жгутиконосцев Leishmania amazonensis, Trypanosoma cruzi (Akaki et al., 2001), гетеротрофных свободноживу-щих жгутиконосцев Goniomonas aff. amphinema (Martin-Cereceda et al., 2010) и споровиков Toxoplasma gondii и Plasmodium falciparum (Akaki et al., 2001, 2002).
До настоящего времени АСМ не использовалась для исследования центрохелидных солнечников. В связи с этим целью данного исследования явилась оценка возможности применения метода АСМ для изучения морфологии кремниевых чешуек и видовой идентификации протистов отряда Centrohelida.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Пробы солнечников отбирали в сентябре и октябре 2010 г. в водоемах Оренбургской обл. и Республики Башкортостан. Образцы воды отбирали в придонном слое после взмучивания донного осадка, транспортировали в лабораторию, где помещали в чашки Петри. Накопительные культуры солнечников получали после массового развития мелких гетеротрофных жгутиконосцев и инфузорий, для которых кормом служила живая культура Pseudomonas fluorescens, которую вносили в чашки Петри бактериологической петлёй в начале культивирования. Чашки Петри в течение месяца просматривали с помощью светового микроскопа под увеличением 100х. Препараты для АСМ готовили путем отсаживания пипеткой Пастера живых клеток солнечников на поверхность обезжиренного покровного стекла, исполняющего роль подложки. Затем препараты высушивали на воздухе, отмывали дистиллированной водой, вновь высушивали и сканировали с помощью атомно-силового микроскопа.
Сканирование образцов проводили с помощью атомно-силового микроскопа СММ-2000 (ЗАО "Завод Протон-МИЭТ", Россия) на воздухе в контактном режиме. Радиус кривизны иглы используемых треугольных кантилеверов MSCT-AUNM ("Veeco", США) жесткостью 0.01 Н/м порядка 10—15 нм. Сканирование, обработку, а также получение графических изображений профиля для морфометрического анализа проводили с использованием программного обеспечения
микроскопа Scan Master. Реконструкцию трехмерных изображений проводили с помощью программы Femtoscan 2.3.106. Средние размерные характеристики приведены с указанием среднего квадратичного отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В результате проведенного исследования получены серии двумерных изображений, на которых были выделены три морфологических варианта центрохелидных солнечников, встречающихся в исследуемых пробах. На основе двумерных изображений были построены трехмерные скано-граммы и графические изображения профиля измеряемых элементов перипласта. Анализ полученных сканограмм позволил идентифицировать три вида центрохелид и изучить их морфологические особенности.
В работе использована макросистема протистов (Dürrschmidt, Patterson, 1987), система Centrohelida (Микрюков, 2002).
Царство Protista Haeckel 1866 Тип Centroheliozoa Dürrschmidt et Patterson 1987 Класс Centrohelea Cavalier-Smith 1993
Отряд Centrohelida Kühn 1926 Семейство Heterophryidae Poche 1913 Род Heterophrys Archer 1869 Heterophrys marina Hertwig et Lesser 1874
Перипласт диаметром 37.0 ± 1.8 мкм, представленный беспорядочно расположенными радиальными спикулами, окруженными слизистым кожухом гетерогенного характера (рис. 1а, 1б). Спикулы равномерной толщины, резко сужаются к острым верхушкам, имеют длину от 8.3 до 11.0 мкм (рис. 1б). Длина спикул примерно равна диаметру овального клеточного тела, размеры которого составляют 20.7 ± 0.9 х 11.3 ± 0.2 мкм.
В публикациях других авторов не указаны размерные характеристики спикул данного вида, за исключением диаметра перипласта от 9 до 45 мкм. В остальном морфология полностью соответствуeт описанной ранее.
Семейство Raphidiophryidae Mikrjukov 1996
Род Polyplacocystis Mikrjukov 1996
Polyplacocystis ambigua (Penard 1904) Mikrjukov 1996
Кремниевые элементы представляют собой тангентальные пластинчатые чешуйки, окруженные полой маргинальной каймой.
Диаметр перипласта P. ambigua 40.0 ± 1.2 мкм. Графические изображения профиля чешуек поз-
Рис. 1. Сканограммы перипласта Heterophrys marina: a — фрагмент перипласта; б — увеличенный маргинальный фрагмент перипласта в слизистом кожухе (рс — радиальные спикулы, ск — слизистый кожух). Масштаб (мкм): а — 5, б — 2.
Рис. 2. Сканограммы перипласта Polyplacocystis ambigua: а—в — двухмерные изображения, г—е — трехмерные изображения; а, г — маргинальные фрагменты перипласта; б, д — центральные фрагменты перипласта; в, е — овальная чешуйка (вч — веретеновидная чешуйка, оч — овальная чешуйка, эч — эллиптическая чешуйка, яэ — ямки от экструсом). Масштаб (мкм): а, б, г, д — 5; в, е — 1.
волили вычислить значения измеренных характеристик. Перипласт представлен тремя типами тангентальных чешуек: 1) длинные, узкие, вере-теновидные, с остро оканчивающимися верхуш-
ками 7.5—11.5 х 0.6—0.7 мкм (рис. 2а, 2г); 2) узко эллипсоидные со слегка заостренными полюсами 4.1—7.4 х 1.9—3.2 мкм (рис. 2б, 2д); 3) овальные, с широко округлыми полюсами 3.7—6.2 х 1.5—2.9 мкм
Рис. 3. Ямки от экструсом: а — двухмерное изображение, б — трехмерное изображение. Масштаб: a — 0.5 мкм.
Рис. 4. Сканограммы маргинального фрагмента перипласта Raineriophrys erinaceoides: а — двухмерное изображение, б — трехмерное изображение (аг — аксиальный гребень, бк — базальное крыло, пч — пластинчатые чешуйки, рс — радиальные спикулы). Масштаб: 3 мкм.
(рис. 2б, 2в, 2д, 2е). Чешуйки всех типов обрамлены хорошо выраженной на АСМ-изображениях гладкой маргинальной каймой.
В публикациях других авторов (Микрюков, 2002; Siemensma, 1991) приводятся размеры вере-теновидных чешуек 10—15 х 0.4—0.7 мкм, соответствующие характеристикам, измеренным нами. Разме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.