научная статья по теме ИЗУЧЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ПРОТЕИНАЗ СТАТИСТИЧЕСКИМ АНАЛИЗОМ МАЛДИ МАСС-СПЕКТРОВ ПРОДУКТОВ ПРОТЕОЛИЗА Химия

Текст научной статьи на тему «ИЗУЧЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ПРОТЕИНАЗ СТАТИСТИЧЕСКИМ АНАЛИЗОМ МАЛДИ МАСС-СПЕКТРОВ ПРОДУКТОВ ПРОТЕОЛИЗА»

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 1, с. 31-36

УДК 577.152.3414:543.51

По материалам доклада на VII Всероссийской конференции "Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция" (30 июня — 4 июля 2014 года, г. Петрозаводск)

ИЗУЧЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ПРОТЕИНАЗ СТАТИСТИЧЕСКИМ АНАЛИЗОМ МАЛДИ МАСС-СПЕКТРОВ

ПРОДУКТОВ ПРОТЕОЛИЗА

© 2015 г. Н. Л. Еремеев#, А. В. Борзенкова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Химический факультет, 119991, Москва, Ленинские Горы, 1, стр. 3 Поступила в редакцию 09.06.2014 г. Принята к печати 22.07.2014 г.

Проведена экспериментальная верификация метода изучения первичной специфичности протео-литических ферментов статистическим анализом масс продуктов протеолиза белковых субстратов на протеиназах с известной субстратной специфичностью (глутамилэндопептидаза и трипсин). Предлагаемый метод не требует прямого определения аминокислотной последовательности продуктов протеолиза, достоверно определяет протеиназы с узкой субстратной специфичностью и относительно толерантен к наличию в МАЛДИ масс-спектрах продуктов протеолиза пиков посторонних загрязнений. Показано, что для исключения ложноположительных результатов необходимо использовать набор белковых субстратов с последующим усреднением получаемых статистических данных.

Ключевые слова: протеолитические ферменты, первичная специфичность, матрично активированная лазерная десорбция-ионизация (МАЛДИ), масс-спектрометрия.

БОТ: 10.7868/80132342315010042

ВВЕДЕНИЕ

Ранее [1] нами были теоретически исследованы возможности и ограничения метода изучения первичной специфичности протеолитических ферментов статистическим анализом МАЛДИ-масс-спектров продуктов протеолиза белковых субстратов (под первичной специфичностью подразумевают избирательность фермента по отношению к аминокислоте, образующей гидролизуемую амид-ную связь своей карбоксильной группой — Р1-по-ложение субстрата по классификации Шехтера-Бергера [2]). Идея предложенного метода заключается в следующем. Проводят гель-электрофорез в восстанавливающих и денатурирующих условиях белка-субстрата с известной аминокислотной последовательностью. Полосу геля с субстратом подвергают протеолизу изучаемой протеиназой. МАЛДИ-масс-спектр реакционной смеси (по-

Сокращения: МАЛДИ — матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация; НССА — 4-гидрокси-а-циано-коричная кислота; ВНБ — 2,5-дигидроксибензойная кислота.

# Автор для переписки (тел.: +7 (495) 939-34-17, факс: +7 (495) 939-54-17; эл.почта: eremeev@enzyme.chem.msu.ru).

скольку в методе МАЛДИ образуются практически только однозарядные ионы [3]) дает набор масс продуктов протеолиза.

С помощью программы FindPept, теоретически можно найти все пептиды белкового субстрата, совпадающие по массе с тем или иным экспериментально полученным значением в пределах некоторого диапазона ошибки измерения (генерируемый набор пептидов). Местоположение этих пептидов в аминокислотной последовательности субстрата позволяет выделить для каждого из них две аминокислоты (для С- и ^-концевых пептидов одну), после которых потенциально произошел гидролиз с образованием данного продукта (со статистической точки зрения событие произошло). Подобную процедуру проводят для каждой массы в масс-спектре, в результате чего получают набор произошедших событий. Специфичные для данной протеиназы аминокислоты в обязательном порядке будут присутствовать в наборе генерированных пептидов для каждой теоретически полученной массы, в то время как неспецифичные будут присутствовать случайным образом. Следовательно, первичная специфич-

ность протеиназы должна проявляться в максимальной частоте встречаемости той или иной аминокислоты при статистическом анализе полученного набора.

Определение первичной специфичности является обязательным этапом характеристики любой новой протеазы и проводится с использованием синтетических или природных субстратов. К синтетическим субстратам относятся амиды ^-заме-щенных аминокислот, а также ди-, три- и олиго-пептиды с С-концевой амидной группой. В этом случае определяют константы гидролиза в сериях гомологичных субстратов и на основании их сопоставления делают вывод о преимущественном предпочтении данным ферментом определенной аминокислоты в Р1-положении [4—6]. Данный метод требует хорошей синтетической базы, длительной кинетической работы и не дает информации о вторичной специфичности фермента.

При использовании природных белковых субстратов требуется разделение продуктов протео-лиза с последующим определением их структуры. Это позволяет выявить гидролизуемые пептидные связи и в результате статистического анализа определить не только первичную, но и вторичную специфичность протеиназы [7]. Однако для определения структуры полипептидов ^-концевым секве-нированием [8—10] необходимо хорошее хромато-графическое разделение продуктов протеолиза и большие количества реагентов. Использование же для этой цели тандемной масс-спектрометрии [11—13] не всегда оправдывается экономически.

Следует отметить, что попытки прямого определения местоположения продукта протеолиза белкового субстрата исключительно по его массе (а только такую информацию и дает МАЛДИ-масс-спектр) наталкиваются на ряд препятствий. Существует так называемый дефект массы пептидов, заключающийся в разнице между их номинальной расчетной и экспериментально определяемой моноизотопной массами. Эта разница линейно возрастает с увеличением массы пептида и, по разным оценкам, имеет тангенс угла наклона от 4.55 х 10-4 [14] до 5.7 х 10-4 [15] (в среднем 4.99 х 10-4 [16]). Так, например, в работе [17] эта разница достигала 8 Да, в силу чего, для уточнения последовательности продуктов протеолиза, авторы данной статьи прибегали к тандемной масс-спектрометрии или секвенированию по Эдману. Предлагаемый же нами метод не требует прямого определения аминокислотной последовательности продуктов протео-лиза и весьма прост инструментально.

Цель настоящей работы заключалась в экспериментальной верификации метода изучения первичной специфичности протеолитических ферментов статистическим анализом масс продуктов протеолиза белковых субстратов на примере известных протеиназ с различной субстратной спе-

цифичностью — трипсине и глутамилэндопепти-дазе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенный ранее теоретический анализ предлагаемого метода определения первичной специфичности протеиназ выявил ряд его ограничений [1]. Во-первых, этот подход не может быть реализован для ферментов с относительно широкой субстратной специфичностью. Во-вторых, молекулярная масса белкового субстрата не может превышать 80 кДа. В-третьих, возможно получение ложноположительных результатов для неспецифичных аминокислот, особенно если их содержание в субстрате мало. В этой связи для экспериментальной верификации метода были выбраны протеиназы с узкой субстратной специфичностью: — трипсин (положительно заряженные аминокислоты — аргинин и лизин) и глутамилэндопептидаза (отрицательно заряженные аминокислоты — глутаминовая и аспараги-новая кислоты) соответственно. В качестве белковых субстратов были выбраны относительно низкомолекулярные куриный лизоцим (М.м. около 16 кДа) и катепсин L камчатского краба Paralithodes camtschaticus (М.м. 35.4 кДа).

Масс-спектры продуктов протеолиза конкретного субстрата обеими выбранными протеиназа-ми воспроизводились достаточно хорошо. Можно отметить разницу в относительных интенсивностях тех или иных пиков в различных спектрах (данные не приведены). Не все массы проявляются в повторных экспериментах (это связано с высоким заданным уровнем отношения сигнал/шум — не менее 10), однако коэффициент взаимопересечения достоверно определяемых масс между тремя параллельными спектрами для каждой пробы составлял не менее 70—80%. Полученные наборы масс продуктов протеолиза приведены в таблице.

Для каждой экспериментально определенной массы в используемом субстрате находили соответствующие по массе пептидные последовательности в пределах разброса ±1 Да. Аминокислотам, найденным в Р1-положении, присваивали значение а, = 1 (г — индекс конкретной аминокислоты) и суммировали эти значения по всему набору генерированных пептидов А, = 2аг. Полученную сумму событий нормировали на содержание данной аминокислоты п1 в используемом субстрате:

АI = —. С целью сравнения результатов, полупи

ченных таким образом для различных ферментов

и белков-субстратов, величины АI дополнительно нормировали на максимальное значение, получаемое в конкретном эксперименте, и выражали в процентах.

ИЗУЧЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ПРОТЕИНАЗ 33

Массы продуктов гидролиза лизоцима и катепсина L трипсином и глутамилэндопептидазой

Субстрат Массы продуктов после гидролиза

трипсином глутамилэндопептидазой

Лизоцим 1007.367 1347.725 1505.636 1754.074 1030.567 1428.663 1675.676 1784.164 1045.545 1474.186 1706.421 1803.964 1182.674; 1201.076; 1429.411; 1476.025; 1767.856; 1977.562; 2035.698; 2161.321

Катепсин L 1042.561 1271.815 1834.580 2395.957 2871.368 1066.896 1494.195 2002.620 2500.071 3001.865 1235.062 1635.408 2384.597 2588.300 3011.693 1004.276; 1016.311; 1060.448; 1095.469; 1216.720; 1307.720; 1357.889; 1415.935; 1571.585; 1602.039; 1745.163; 2313.622; 2518.415; 2525.743; 2666.587; 2688.582; 3740.307

A «.норм = X 100%.

A i, max

Полученные результаты (рисунок, а—г), позволяют говорить о следующем. Во-первых, при обработке данных по каждой паре фермент/субстрат максимальные статистические веса имеют именно специфичные для данной протеиназы аминокислоты. Однако если для трипсина при протеолизе обоих белковых субстратов максимальный статистический вес имеет лизин по сравнению с аргинином (рисунок, а—в), то для глутамилэндопептидазы максимально статистически значимая аминокислота зависит от гидролизу-емого белка: глутаминовая кислота (рисунок, б) при протеолизе лизоцима и аспарагиновая кислота (рисунок, г) при протеолизе катепсина L. Во-вторых, в ряде случаев появляются ложнополо-жительные результаты. Так, при гидролизе лизо-цима трипсином (рисунок, а) достаточно большой вес имеет пролин, при гидролизе катепсина

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком