Таблица 1. Штаммы бактерий, использованные в данном исследовании
Вид, штамм
Место выделения штамма
географический регион
субстрат
М 4 М 5 М 6 М 7 Тр 3 Тр 4
Метилотрофные бактерии г. Киров
То же
Татарстан
То же
Семена овса Семена овса Семена ячменя Семена ячменя Листья тритикале Листья тритикале
Эпифитные бактерии, не растущие на метаноле
г. Киров
Семена ячменя
Bacillus sp. Н9 То же Семена ячменя
Н16 » Семена ячменя
Н21 Кировская обл. Семена озимой ржи
Н32 То же Семена овса
Фитопатогены
Erwinia rhapontici 1м-33 г. Киров Семена озимой ржи
Erwinia herbicola Мал 1 г. Чанг-Чунь (КНР) Почки малины
Erwinia rhapontici Д 1-2 Кировская обл. Семена озимой ржи
Bacillus sp.10 сл г. Кирово-Чепецк Листья огурца
Pseudomonas cepacia 3809 Получен из Института микробиологии МО РФ г. Киров
»
»
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе были использованы бактериальные изоляты, полученные от различных сельскохозяйственных растений (табл. 1). Для получения метилобактерий применяли метод истощающего посева жидких накопительных культур (выращивание при 27°С на качалке (180 об./мин) в течение 5 сут на минеральной среде с метанолом, содержащей (г/л): КН2Р04 - 2, ^Н4^04 - 2, MgSO4 ■ ■ 7Н20 - 0.125, ШС1 - 0.5, FeSO4 ■ 7Н20 - 0.002, дрожжевой автолизат - 0.1) на агаризованную среду того же состава. Метанол в количестве 1% (по объему) добавляли в среды после стерилизации. О чистоте выделенных культур метилотроф-ных бактерий судили по однородности колоний, а
Таблица 2. Образование ИУК метилотрофными бактериями на синтетической среде с метанолом и триптофаном
Бактериальная ИУК, ИУК,
культура мкг/мл мкг/ед. ОП*
М4 13.5 ± 0.71 48.2 ± 2.5
М5 14.0 ± 0 14.4 ± 0
М6 6.2 ± 2.7 9.3 ± 4.0
М7 11.5 ± 0.71 24.0 ± 1.5
Тр 3 6.0 ± 0 6.9 ± 0
Тр 4 2.8 ± 0.24 3.9 ± 0.33
* ОП - оптическая плотность.
также по результатам световой микроскопии клеток. Морфологические и физиолого-биохи-мические свойства природных изолятов совпадали с признаками бактерий рода Methylobacterium, описанными в определителе Берджи [7].
Эпифитные бактерии, не растущие на метаноле, были изолированы с поверхности семян зерновых культур на среде, содержащей (г/л): глюкоза - 2, сахароза - 2, пептон - 1, дрожжевой экстракт - 1, К2НРО4 - 0.5, NaCl - 0.1; MgSO4 7H2O -0.2, (NH4)S04 - 0.5, СаС12 - 0.2, FeCl3 - 0.01, Na2MoO4 - 0.002. Клетки окрашивали по Граму. У грамнегативных определяли наличие ферментов оксидазы и каталазы. Грамнегативные, ката-лазоположительные и оксидазоотрицательные культуры Н16, Н21, Н32 были отнесены к семейству Enterobacteriaceae. Грамположительные аэробные культуры Н5 и Н9, способные к образованию эндоспор, предварительно отнесены к роду Bacillus.
Для изучения антагонистических свойств ме-тилотрофных и не растущих на метаноле эпифит-ных бактерий использовали в качестве тест-культур фитопатогенные бактерии, выделенные на среде того же состава из тканей больных растений и коллекционный штамм Pseudomonas cepacia 3809 (табл. 1). Антагонистические свойства бактерий определяли путем штрихового подсева тест-культур перпендикулярно росту штриха испытуемого штамма на картофельном агаре [10] с добавлением глюкозы 10 г/л. Искусственные ассоциации для определения антагонистических свойств получали
Таблица 3. Изменение морфометрических показателей проростков пшеницы Приокская в результате обработки семян жидкими культурами испытуемых штаммов
Штамм бактерий Длина корешков Длина проростков Масса растения Всхожесть
% к контролю
Эпифитные бактерии, не растущие на метаноле
Н5 110 139* 80 102
Н9 117* 131* 113* 102
Н16 101 104 117* 99
Н21 101 114* 113* 102
Н32 90 88 96 104
Метилотрофные бактерии
М4 91 111* 94 99
М5 95 102 105 96
М6 97 89 95 100
М7 128* 120* 125* 106
Тр 3 109 117* 125* 105
Тр 4 125* 134* 142* 105
* Достоверно при Р > 099.
путем попарного смешивания в объеме стерильной воды клеток штаммов из различных групп бактерий в соотношении 1 : 1. Антагонистическую активность оценивали по величине зоны подавления роста тест-культуры на 2-4-е сут инкубации. Каждый тест проводили в трехкратной повторности.
Способность метилотрофных бактерий к синтезу индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) определяли с помощью реактива Сальковского по методике [8]. Культуры выращивали на минеральной жидкой среде с добавлением триптофана 500 мкг/мл, аммонийный источник азота был заменен нитратной формой. Оптическую плотность (ОП) бактериальной суспензии измеряли нефелометрически на фотоколориметре с длиной волны 490 нм. Контролем служила питательная среда, на которой выращивали культуры микроорганизмов. Бактериальные клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием в течение 10 мин (6000 об./мин). Определение количества ИУК в культуральной жидкости проводили колориметрически при длине волны 540 нм. Для построения калибровочного графика использовали разведения стандартного раствора ИУК ('Т1иса", Швейцария). Контролем служила неинокулированная среда с добавлением реактива.
Рострегулирующую способность природных изолятов определяли методом рулонной культуры, замачивая проклюнувшиеся семена пшеницы Приокская на 20 час в жидких 5-суточных культурах бактерий (разведение 1 : 100), выращенных на капустной среде [9] при 27°С на качалке (180 об./мин). В контроле семена замачивали в неинокулирован-
ной среде. Семена проращивали в рулонах увлажненной до полной влагоемкости фильтровальной бумаги. Рулоны устанавливали вертикально в химические стаканы и помещали в камеру искусственного климата ILKA (Германия) при температуре 25/18°С (день/ночь) и фотопериоде 16 ч. Через 6 сут определяли показатели всхожести, линейные размеры и сухую массу проростков. В каждом варианте анализировали по 100 растений.
Статистическая обработка данных проведена стандартными методами [11] с использованием программ EXCEL и STATGRAFICS.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе работы изучали некоторые свойства природных изолятов метилобактерий, которые могут иметь значение при взаимодействии с растениями. Известно, что наиболее активным соединением в группе ауксинов является ин-долил-3-уксусная кислота (ИУК). Она ответственна за деление, растяжение и дифференциацию растительных клеток и тканей [12]. Установлено, что количество ауксинов, синтезированных мети-лобактериями, было индивидуально для каждого штамма. Среди природных изолятов, ассоциированных с семенами и листьями злаковых культур, встречались штаммы, синтезирующие ИУК около 11-14 мкг/мл, а также малоактивные штаммы, у которых выход ИУК составил не более 2-3 мкг/мл (табл. 2). Расчет количества образуемой ИУК для удобства сравнения с литературными данными приведен на мл среды и на единицу оптической плотности (ед. ОП).
Способность к образованию ИУК обнаружена при культивировании бактерий на среде с триптофаном, что еще раз подтверждает тот факт, что триптофан является предшественником ауксинов у метилобактерий [13]. Известно, что источником триптофана в ризосфере являются корневые выделения растений [14]. Сообщалось, что эпифит-ная микрофлора, используя триптофан корневых экзометаболитов, может изменять гормональный статус ризосферы, превращая эту аминокислоту в дополнительную экзогенную ИУК, которая, в свою очередь, воздействует на развитие растения-хозяина [15].
В нашей работе положительное влияние эпи-фитных бактерий на растения подтвердилось стимуляцией развития проростков яровой пшеницы в результате замачивания семян в жидких культурах изучаемых штаммов. Результаты определения влияния микроорганизмов на прорастание семян и рост проростков пшеницы представлены в табл. 3. Ни одна из жидких культур микроорганизмов не содержала веществ, достоверно инги-бирующих рост растений, и не вызывала гибели проростков. Среди метилотрофных бактерий достоверно повышали всхожесть семян, линейные
Таблица 4. Антагонистические свойства культур метилобактерий и их ассоциаций с эпифитными бактериями
Штаммы Зона подавления роста тест-культур, мм
бактерий и их ассоциации Erwinia rhapontici 1м-3к Erwinia herbicola Erwinia rhapontici Д1-2 Bacillus sp. 10 сл Pseudomonas cepacia
Н32 0 5 ± 0 12 ± 3.5 0 0
M 4 + Н32 10 ± 0 4 ± 2.5 0 7 ± 0 3 ± 0.2
М 5 + Н32 8 ± 4.3 3 ± 1.4 2.3 ± 1.9 7 ± 2.6 3 ± 0.5
М 6 + Н32 4 ± 2.7 7 ± 3.8 11 ± 1.1 19 ± 5.6 6 ± 2.4
М 7 + Н32 9 ± 6.6 4 ± 3 3 ± 2.3 6 ± 1.2 1 ± 0.6
Тр 3 +Н 32 10 ± 0 18 ± 2.0 13 ± 2.3 13 ± 0.9 12 ± 2.9
Н21 16 ± 1.3 17 ± 1.5 17 ± 1.0 0 11 ± 0
M 4 + Н21 24 ± 6.9 26 ± 7.2 24 ± 1.6 19 ± 2.0 23 ± 2.9
М 5 + Н21 30 ± 4.3 30 ± 3.4 26 ± 1.4 20 ± 0.9 22 ± 0.5
М 6 + Н21 32 ± 0 28 ± 3.5 22 ± 3.3 19 ± 1.7 23 ± 0
М 7 + Н21 28 ± 6.6 30 ± 5.5 32 ± 7.4 24 ± 5.2 25 ± 4.2
Тр 3 + Н21 22 ± 1.2 23 ± 1.7 18 ± 2.3 17 ± 1.7 20 ± 0.5
Тр 4 + Н21 29 ± 0.9 32 ± 2.0 30 ± 0.5 21 ± 0.9 26 ± 1.4
Н16 0 0 0 0 0
М 4 + Н16 3 ± 2.9 1 ± 0.8 1.3 ± 1.2 2.3 ± 1.6 2 ± 1.4
М 6 + Н16 23 ± 1.7 15 ± 2.5 16 ± 2.2 0 4 ± 0
Тр 3 + Н16 21 ± 0.8 19 ± 3.7 11 ± 0.8 0 1.3 ± 0.47
Тр 4 + Н16 9 ± 1.9 12 ± 4.7 13 ± 3.8 0 0
Н9 0 0 0 0 0
M 6 + Н9 21 ± 0.5 23 ± 5.2 15 ± 2.9 0 0
Тр 3 + Н9 2 ± 0 1 ± 0.6 3 ± 0.5 0 1.3 ± 0.9
Н5 0 0 0 0 0
М 6 + Н5 24 ± 2.4 19 ± 4.9 17 ± 3.7 0 0
Тр 3 + Н5 4 ± 2.6 8 ± 3.8 7 ± 2.2 0 5 ± 0.5
размеры и сухую массу проростков штаммы М7, Тр3, Тр4, а среди не использующих метанол эпи-фитных бактерий положительное влияние, проявившееся в увеличении массы и высоты проростка, наблюдали при обработке семян жидкими культурами штаммов Н16, Н9 и Н21.
Следующим этапом работы явилось изучение антагонистических свойств выделенных штаммов бактерий. Монокультуры метилотрофных и большинства эпифитных бактерий, не использующих метанол, не оказали (за исключением штаммов Н21 и Н32) антагонистического действия на фито-патогенные бактерии. Искусственные микробные ассоциации, содержащие одновременно клетки штаммов из разных групп бактерий, подавляли рост фитопатогенных бактерий (табл. 4). Смешанные культуры с участием штамма Н32 и различных штаммов метилобактерий (М4 + Н32; М5 + + Н32; М6 + Н32; М7 + Н32; Тр 3 + Н32) проявили более широкий спектр антагонистического действия (против 4-5 культур), чем собственно штамм Н32 (про
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.