НЕЙРОХИМИЯ, 2015, том 32, № 1, с. 48-56
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 615.21+612.014
ИЗУЧЕНИЕ ПОВЕДЕНИЯ И СОДЕРЖАНИЯ НЕЙРОТРАНСМИТТЕРОВ В СТРУКТУРАХ МОЗГА КРЫС С МОДЕЛИРУЕМОЙ ВВЕДЕНИЕМ Ар25-3,
БОЛЕЗНЬЮ АЛЬЦГЕЙМЕРА © 2015 г. С. А. Литвинова*, П. М. Клодт, В. С. Кудрин, В. Б. Наркевич, Т. А. Воронина
Лаборатории психофармакологии и нейрохимической фармакологии ФГБУ "НИИфармакологии им. В.В. Закусова"РАМН
Изучались поведение и нейрохимические изменения, вызванные моделированием болезни Альц-геймера (БА) путем билатерального введения Ар25_35 (по 7.5 нмоль) в желудочки мозга крыс. Через 5.5 нед у крыс с выраженным симптомокомплексом, характерным для БА, наблюдалось развитие когнитивных и психоэмоциональных нарушений в тестах пространственного обучения по Моррису и вынужденного плавания по Порсолту. Определение содержания моноаминов и их метаболитов в структурах мозга крыс проводили методом ВЭЖХ с ЭХД на следующий день после завершения тестов. Установлено, что в дорсальном стриатуме крыс с БА отмечалось снижение содержания метаболитов дофамина (ДА): ГВК (гомованилиновая кислота), ДОФУК (3,4 диоксифенилуксусная кислота), 3-МТ (3-метилтирамин) и уменьшение величины комплексных показателей, характеризующих скорость утилизации ДА — ДОФУК/ДА и ГВК/ДА, тогда как концентрация самого ДА в этой структуре не изменялась. В прилежащем ядре (ПЯ, вентральный стриатум) наблюдалось снижение оборота внеклеточного ДА, регистрируемое по уменьшению показателя ГВК/ДА. В этой же структуре регистрировалось замедление оборота серотонина (5-ОТ) по показателю 5-ОИУК (5-оксиин-долуксусная кислота)/5-ОТ при увеличении уровня самого 5-ОТ. В гипоталамусе выявлено достоверное снижение содержания ДА и его метаболитов 3-МТ, ГВК, а также оборота 5-ОТ. При исследовании эффектов АР25-35 на параметры аминацидергической нейропередачи отмечалось статистически достоверное увеличение содержания глутамата в стриатуме. Результаты работы свидетельствуют об участии дофамин- (тубероинфундибулярной, мезолимбической, нигростриарной), серотонин- и глутаматергической (в стриатуме) нейротрансмиттерных систем мозга в патофизиологических механизмах развития когнитивных и психоэмоциональных нарушений, возникающих при БА, моделируемой введением Ар25_35.
Ключевые слова: болезнь Альцгеймера, А$25_35, метаболизм моноаминов, структуры мозга, жидкостная хроматография, депрессия, когнитивные нарушения, лабиринт Морриса.
Б01: 10.7868/81027813315010057
ВВЕДЕНИЕ
В исследованиях последних лет показано, что дофаминергическая система повреждается одной из первых при развитии различных нейродегене-ративных состояний. При болезни Паркинсона гибель дофаминергических нигростриарных нейронов является ведущим механизмом патогенеза, при этом даже на домоторной стадии развития болезни потеря дофаминсодержащих нейронов составляет около 60% [1, 2]. Потеря дофаминергических нейронов с последующим уменьшением стриарного дофамина на 40—70% также отмечается более чем у 35 % пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера [3—5]. В связи с этим, наряду с появлением когнитивных нарушений, у паци-
*Адресат для корреспонденции: 125315, Москва, Балтийская ул., 8, тел. (495) 601-21-14, e-mail: sa_litvinova@mail.ru.
ентов с БА возникают экстрапирамидные и психоэмоциональные расстройства, сходные с таковыми при болезни Паркинсона [6, 7]. Развитие этих клинических признаков при БА связывают с изменением функционального состояния не только дофаминергической, но и серотонинерги-ческой нейромедиаторных систем [8—10]. Так, у пациентов с БА, мягкими когнитивными нарушениями (mild cognitive impairment), а также с депрессией в спинномозговой жидкости обнаруживается снижение содержания метаболитов дофамина (ДА) — гомованилиновой кислоты (ГВК) и серотонина (5-ОТ) — оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК), что свидетельствует либо об уменьшении содержания ДА и 5-ОТ в тканях мозга, либо о замедлении их метаболизма [11]. Накопление Р-амилоидных бляшек является одним из ключевых звеньев патогенеза БА и причиной ги-
бели нейронов [12]. Внутримозговое введение животным Aß1-40 в ретросплениальную кору снижает количество дофаминергических и норадре-нергических нейронов в голубом пятне на 57% и 35% соответственно, серотонергических на 32% в дорсальном ядре шва и на 54% в среднем ядре шва, а также холинергических нейронов на 24% в латеродорсальном ядре покрышки [13].
Цель настоящей работы — изучение поведения (когнитивных функций и депрессивного состояния) и функционирования моноаминергической (дофаминергической, серотонинергической, но-радренергической) и аминацидергической ней-ротрансмиттерных систем мозга крыс после введения в желудочки мозга Aß25-35.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проводились на белых беспородных крысах-самцах массой 300—320 г (питомник РАМН "Столбовая"), содержавшихся в условиях лабораторного вивария при естественном освещении со свободным доступом к воде и стандартному корму ad libitum. Эксперименты проводились в соответствии с международными правилами гуманного обращения с животными, утвержденными (European Communities Council Directive of November 24,1986 (86/609/EEC)), а также этической комиссией ФГБУ "НИИ фармакологии им. В.В. Закусова" РАМН.
Моделирование болезни Альцгеймера (БА) проводили путем введения амилоидного пептида 25—35 (Aß25-35) в мозг крысы [14]. Aß25-35 является гидрофобным С-терминальным фрагментом амилоида 1-42, который является основным компонентом сенильных бляшек при БА. Aß25-35 (Sigma, USA) растворяли в бидистиллированной воде в концентрации 1.5 нмоль/мкл и выдерживали в течение четырех дней при температуре 37°С для агрегации пептида [15].
В исследовании использовали протокол, разработанный Степаничевым [16], согласно которому осуществляли билатеральное введение фрагмента ß-амилоида — Aß25- 35 в желудочки мозга в соответствии с координатами стереотак-сического атласа Буреша (AP — 1 мм, L — 1.5 мм, Н — 3.5 мм) [17]. Каждая экспериментальная группа состояла из девяти животных. Наркотизированным хлоралгидратом (350 мг/кг) крысам вводили билатерально агрегированный Aß25-35 по 7.5 нмоль в каждый желудочек мозга. Ложноопе-рированным крысам в желудочки мозга вводили бидистиллированную воду в эквивалентных объемах.
Когнитивные нарушения оценивали через 5.5 нед после моделирования БА, используя методику пространственного обучения в водном лабиринте Морриса с модификациями [18—20]. Бас-
сейн диаметром 190 см наполняли водой комнатной температуры (24 ± 2°С). Бассейн зрительно делился на четыре сектора и в одном и том же секторе (называемом "целевым") помещалась платформа диаметром 12 см, погруженная на 1.5 см ниже уровня воды. В водном лабиринте Морриса животное обучается избеганию принудительного плавания путем нахождения платформы. Обучение проводили в течение трех дней по две сессии обучения в день с разных позиций N (север) и W (запад) с интервалом 1.5 ч без изменения положения платформы. Через 48 часов после последней процедуры обучения воспроизводили навык на пяти день. Каждому животному давали 120 с для нахождения платформы. Изменение времени поиска платформы в течение трех дней обучения расценивали как проявление кратковременной памяти, а между последней сессией обучения и воспроизведением — как долговременной [21, 22].
Через 6.5 нед после моделирования БА оценивали степень развития депрессивноподобного состояния у животных в тесте "вынужденного плавания" по Порсолту [23]. Согласно классическому варианту этого теста, крыс помещали в неизбегаемые условия стеклянного цилиндра (46 х 20 см), наполненного водой (27—26°С) до высоты 30 см двукратно с промежутком в 24 ч на 10 и 6 мин соответственно. Регистрировали время иммобилизации животного в секундах. Иммобилизацией считали состояние полной неподвижности крысы, при которой она совершала только необходимые для поддержания на плаву движения.
Декапитацию животных проводили через 7 нед после моделирования БА (введения Ар25-35). Структуры мозга (фронтальная кора (ФК), гипоталамус (Гпт), прилежащее ядро (ПЯ), дорсальный стриатум (Стр) и гиппокамп (Гип)) извлекались на льду, замораживались в жидком азоте и взвешивались. Выделенные структуры мозга крыс размельчали в гомогенизаторе "стекло-тефлон" (0.2 мм) при скорости вращения пестика 3000 об./мин. Гомогенизацию осуществляли в 0.1 Н НСЮ4 с добавлением в качестве внутреннего стандарта 3,4-диоксибензиламина (ДОБА) в количестве 0.5 нмоль/мл. Пробы центрифугировали при 15000 g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость в количестве 20 мкл фильтрата наносили на аналитическую колонку методом прямой инъекции. НА (норадреналин), ДОФУК (3,4 ди-оксифенилуксусную кислоту), ДА (дофамин), ГВК (гомованилиновую кислоту), 3-метилтира-мина (3-МТ), 5-ОИУК (5-оксииндолуксусную кислоту) и 5-ОТ (серотонин, 5-окситирамин) разделяли на термостатируемой при 35°С колонке с использованием в качестве подвижной фазы 0.1 М цитратно-фосфатного буфера, содержащего 0.3 мМ октансульфоната натрия, 0.1 мМ ЭДТА и 10%-го ацетонитрила (рН 3.2). Определение мо-
50 ЛИТВИНОВА и др.
Таблица 1. Исследование нарушения пространственного обучения крыс с БА, вызванного внутримозговым введением АР25—35, в водном лабиринте Морриса (М ± S.E.M.)
Дни теста Место посадки Латентное время нахождения платформы (ЛП), с
ложноопериро-ванные ложноопериро-ванные (N + W) животные с Aß25_35 животные с Aß25 35 (N + W)
1-й N 109.1 ± 8.9 92.39 ± 6.92 109.2 ± 7.1 78.67 ± 8.85
W 75.7 ± 13.4 48.1 ± 14.0
2-й N 55.1 ± 13.2 43.78 ± 6.57# 82.9 ± 11.0 68.39 ± 12.27@
W 32.4 ± 9.8 53.9 ± 17.2
3-й N 30.7 ± 9.5 28.39 ± 5.84 48.7 ± 14.7 37.75 ± 11.8
W 26.1 ± 6.9 28.6 ± 14.9
5-й N 26.6 ± 8.7 61.0 ± 16.6*
* Достоверность различий по сравнению с ложнооперированными, при Р < 0.05 (критерий Манна—Уитни); # достоверность различий по сравнению с 1-м днем обучения ложнооперированных крыс, при Р< 0.05 (критерий Уилкоксона); @ тенденция к достоверности различий по сравнению с ложнооперированными, при Р = 0.098 (однофакторный дисперсионный анализ). Примечание. N — север, W — запад.
ноаминов и их метаболитов осуществляли на стеклоуглеродном эле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.