РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2008, том 2(11), № 4 с. 389-397
= ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ -
ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ПОСТТРАНСЛЯЦИОННЫХ МОДИФИКАЦИЙ РЕЦЕПТОРА СМЕРТИ CD95/FAS/АРО-1 И АССОЦИИРОВАННЫХ С НИМ МОЛЕКУЛ В ПЕРЕДАЧЕ СИГНАЛА В ЛИМФОЦИТАХ
© 2008 г. О.М. Шатнева, А.В. Кубаренко, А. Голькс,
И.Н. Лаврик
Немецкий научный центр раковых исследований, Гейдельберг, Германия
Поступила: 15.09.08 г. Принята: 25.09.08 г.
Рецептор CD95 (APO-1/Fas) играет ключевую роль в индукции апоптоза в клетках эукари-от. Данная работа посвящена изучению влияния пострансляционных модификаций рецептора CD95 на инициацию апоптоза. Установлено, что CD95 рецептор в различных клеточных линиях Т- и В-лимфоцитов существует в различных формах, которые отличаются молекулярной массой. Интересной особенностью данных клеточных линий была различная скорость инициации апоптоза. Роль О-гликозилирования и фосфорилирования рецептора CD95, а также О-гликозилирования цитоплазматических компонентов сигнального комплекса, образующегося при взаимодействии рецептора CD95 с CD95 лигандом, была изучена с помощью широкого спектра энзиматических и иммунологических методов. Обнаружено, что рецептор CD95 в изучаемых клеточных линиях Т и В-лимфоцитов не подвергается данным пострансляционным модификациям, и, соответственно, что эти модификации не влияют на различную скорость индукции апоптоза. Анализ О-гликозилиро-вания по типу ^ацетилглюкозаминирования основных белков рецепторного комплекса показал отсутствие этой модификации. Таким образом, было установлено, что клеточные линии Т и В-лимфоцитов, отличающиеся по скорости инициации апоптоза, характеризуются различными формами рецептора CD95, но, в то же время, наличие различных форм рецептора СЭ95 не связано с перечисленными выше посттрансляционными модификациями. Дальнейшие исследования необходимы для понимания детального механизма инициации апоптоза через рецепторный комплекс CD95.
Ключевые слова: апоптоз, лимфоциты, CD95, гликозилирование
ВВЕДЕНИЕ
Программируемая клеточная смерть или апоптоз является неотъемлемым свойством клеток высших эукариот [1]. Апоптоз играет центральную роль в гомеостазе многих клеток иммунной системы, в частности, лимфоцитов [1]. Существует несколько механизмов, запускающих клеточную гибель: в ответ на повреждения ДНК, при отсутствии факторов роста, а также в ответ на активный сигнал смерти, передаваемый секретируемыми или связанными на мембране цитокинами. Сигнал смерти, передаваемый секретируемыми или связанными на мембране цитокинами, передается через так называемые рецепторы смерти [1, 2].
Адрес: E-mail: i.lavrik@dkfz.de
В настоящее время охарактеризовано 6 рецепторов смерти: Фактор некроза опухоли (ФНО, TNF-R1), Fas/CD95/APO-1, TRAIL-R1, TRAIL-R2, DR3, DR6 [2]. Объединение их в одно семейство связано с наличием в их структуре так называемого домена смерти (Death Domain, DD). Каждый рецептор смерти активируется своим лигандом. При связывании соответствующего лиганда происходит образование сигнального рецепторного комплекса, который инициирует апоптоз.
Наиболее полно изучен механизм передачи сигнала клеточной гибели через рецептор CD95 [1, 3]. Именно индукция апоптоза через CD95 играет центральную роль в гомеостазе лимфоцитов [1]. Образование активного рецепторного комплекса, называемого DISC (death-inducing signaling complex), происходит в течение нескольких секунд после взаи-
390 А
! Death ligand ¡ Death receptor
Type I
Procaspases-8/10
il f DISC
1—1 ^^US/R
Type II
caspase-8
Procaspases-3/6/7
1-1 IAPs I
caspases-3/6/7
SKW6,4
Jurkatl6
anti-APO-1
CD95 -p-CD95
■ I n«< I —- +
™П Bd-J
Ba^
i xiap I CytC * Procaspase-9 p55/p53 _
caspase-9
LaminA Actio Gas2 Fodrin Gelstiin PKc Apoptosome Rb \ ICAD PARP"
в
SKW6,4
Jurkatl6
p43/p41.
анти-каспаза ВБ
APOPTOSIS
Рис. 1. (А) Схема двух типов передачи сигнала через рецептор CD95. (Б) Анализ комплекса DISC рецептора CD95 в двух типах клеточных линий: SKW6.4 (тип I) и Jurkat 16 (тип II). К 5 х 107 клеток были добавлены агонистические антитела anti-APO-1 (концентрация 1 цг/мл), с последующей иммунопреципитацией. Анализ прокаспазы-8 и CD95 был проведен с помощью Вестерн-блоттинга с помощью специфических антител С20 и С15 против прокаспазы-8 и CD95, соответственно. Прокаспаза-8 (р55/р53) и продукт процессинга прокаспазы-8 (р43/р41) обозначены стрелками. (В) Экспрессия CD95 на поверхности была проанализирована с помощью проточной цитофлуоримет-рии с использованием агонистических моноклональных IgG3 антител к CD95 анти-APO-l. В качестве контрольных антител использованы моноклональные антитела IgG3 FII23.
модействия CD95 лиганда с рецептором [3]. После этого с рецепторным комплексом связывается белок FADD (Fas-Associated Death Domain). FADD является адаптерным белком, так как содержит в своей структуре два домена — DD домен, который связывается с DD доменом рецептора CD95 за счет гомотипиче-ского белок-белкового взаимодействия, и DED (death effector domain) домен, который необходим для связывания молекул прокаспазы-8 и белка FLIP (FLICE-inhibitory protein). Прокаспаза-8 является главным инициатором апоптоза. После связывания в рецепторный комплекс прокаспаза-8 подвергается аутопро-телитической активации с образованием активной формы каспазы-8. На следующих этапах происходит активация каспаз-3 и -7, а затем субстратов апоптоза [2] (Рис. 1А, схема).
Характерной особенностью механизма передачи сигнала смерти через рецептор CD95 является наличие двух различных типов сигнальных путей, которые встречаются в различных типах клеток [4] (рис. 1А). Первый тип клеток характеризуется повышенным содержанием комплекса DISC и, соответственно, активной каспазы-8, которая затем расщепляет прокаспазы-3 и -7 [4]. Во втором типе клеток комплекс CD95 DISC образуется менее эффективно, что приводит к образова-
нию каспазы-8 в гораздо меньших количествах, чем в первом типе клеток. Поэтому во втором типе клеток для эффективного запуска апоптоза необходима амплификация сигнала, которая происходит по следующему механизму: активированная каспаза-8 расщепляет молекулу Bid, и образовавшийся фрагмент tBid транслоцируется в митоходрии, что приводит к выходу цитохрома С в цитоплазму, образованию апоптосомы, последующей активации каспазы-9, которая, в свою очередь, расщепляет и при этом активирует кас-пазы-3 и -7 (рис. 1А). Было показано, что к первому типу клеток относятся клеточные линии В лимфоцитов: SKW6.4, Raji, BJAB; клеточные линии Т-лимфоцитов Hut78, а также периферические Т-клетки. Было установлено, что ко второму типу клеток относятся клеточные линии Т-лимфоцитов СЕМ и Jurkat [4].
Природа различий между клетками первого и второго типа пока не установлена. По одной из гипотез регуляция происходит на уровне образования комплекса DISC рецептора CD95 за счет различных посттрансляционных модификаций белков рецепторно-го комплекса, в первую очередь, рецептора CD95. Рецептор CD95 является N-гликопро-теином [5], но было показано, что гликози-лирование не является причиной различий
между клетками первого и второго типа. Соответственно, важной задачей явился анализ других возможных модификаций рецептора CD95, которые могли бы приводить к активному формированию комплекса DISC рецептора CD95 и, соответственно, активации каспазы-8 в клетках первого типа, и к пониженному образованию комплекса DISC и активной каспазы-8 в клетках второго типа. Проверка данной гипотезы была целью данной работы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реактивы и биопрепараты
В работе были использованы следующие реактивы и материалы: 1,4-дитио-DL-треитол (DTT), ^^№,№-тетраметил-этилендиамин (TEMED), мочевина, додецилсульфат натрия (SDS), акриламид, ^^-метиленбисакрил-амид, протеин А-сефароза фирмы Serva, персульфат аммония, хлорид аммония, бромфе-ноловый синий, фирмы Merk, О-гликозидаза и сиалидаза из Vibrio Cholerae фирмы Sigma. Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain был от компании Invitrogen.
В работе были применены клеточные линии В-лимфоцитов SKW6.4 и Т-лимфоцитов: Jurkat16 и JurkatA3; первичные Т-клетки, находящиеся в культуре с первого по шестой день; клеточная линия HeLa, с повышенной экспрессией CD95 рецептора (HeLa-CD95). Были использованы среды для культивирования клеток RPMI фирмы Gibco. LZ-CD95L был приготовлен, как описано ранее [6]. Моно-клональные антитела против каспазы-8-С15, а также антитела против CD95-anti-APO-1 были приготовлены в лаборатории согласно ранее описанному методу [7, 8]. Были использованы поликлональные антитела для рецептора CD95 (С20) фирмы Santa Cruz и моноклональ-ные антитела RL2 для N-aцетилглюкозамина фирмы Abcam.
Иммунопреципитация рецептора CD95
К 5 х 107 клеток были добавлены лиганд LZ-CD95L (концентрация 1 цг/мл) [6] или агони-стические антитела anti-APO-1 (концентрация 1 цг/мл) [8]. Инкубацию проводили в течение 10 минут при температуре 37 °С. Получение клеточных лизатов, иммунопреципита-цию комплекса и Вестерн-блоттинг проводили как описано в [9, 10].
О-дегликозилирование
5 х 107 клеток были обработаны ферментом сиалидазой в течение часа при температуре 37°С, с последующей обработкой рекомби-нантной О-гликозидазой из Streptococcus pneumoniae в течение 2 часов при температуре 37°С.
Анализ N-ацетилглюкозаминирования
Анализ N-ацетилглюкозаминирования проводили методом иммунопреципитации с последующим анализом при помощи Вес-терн-блоттинга против каспазы-8, FLIP, FADD и N-ацетилглюкозамина. К 5 х 107 клеток были добавлены моноклональные антитела RL2 в концентрации 1 дг/мл против N-ацетилглюкозамина; иммунопреципита-цию проводили согласно методу, описанному в [9, 10]. Иммунопреципитацию FLIP, FADD и прокаспазы-8 проводили согласно методу, описанному в [11].
Анализ фосфорилирования
CD95 рецептор иммунопреципитировали из 5 х 107 клеток HeLa-CD95 согласно методу, описанному в [11], и добавления ванадата натрия в концентрации 1 мМ для ингибирова-ния фосфатаз. Затем иммунопреципитаты и клеточные лизаты наносили на полиакрила-мидный гель. Фосфорилирование белков детектировали методом прямого избирательного проявления фосфорилированных бе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.