ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия Б, 2009, том 51, № 12, с. 2190-2198
СИНТЕЗ
УДК 541.64:547.466.1
ИЗУЧЕНИЕ СИНТЕЗА ПОЛИГЛУТАМИНОВЫХ КОНЪЮГАТОВ ЛИЗИНОВЫХ ДЕНДРИМЕРОВ В РАСТВОРЕ И В ПОЛИМЕРНОМ ГЕЛЕ1
© 2009 г. Г. П. Власов, И. И. Тарасенко, Г. А. Панкова, И. Е. Ильина
Учреждение Российской академии наук Институт высокомолекулярных соединений РАН 199004 Санкт-Петербург, Большой пр., 31 Поступила в редакцию 06.05.2008 г.
Принята в печать 24.11.2008 г.
Изучены закономерности синтеза полиглутаминовых конъюгатов лизиновых дендримеров, в которых полиглутаминовые фрагменты связаны одноточечно своими карбоксильными концами с аминогруппами М-концевых лизиновых фрагментов дендримеров. Предварительно на полимерном носителе — сшитом п-метилбензгидриламинополистироле — осуществлен твердофазный синтез лизиновых дендримеров третьей, четвертой и пятой генерации. Первый подход к синтезу полиглутаминовых конъюгатов дендримеров состоял в том, что после завершения синтеза лизиновых дендримеров, их удаления с полимерного носителя, полного деблокирования и очистки проводили полимеризацию М-карбоксиангидрида у-бензилглутамата на аминогруппах лизина внешней сферы дендримеров в растворе. Второй подход состоял в том, что полимеризацию М-карбоксиангидрида у-бензилглута-мата на аминогруппах М-концевых остатков лизина лизиновых дендримеров осуществляли до удаления дендримеров с полимерного носителя. Изучение строения звездообразных полиглутамино-вых конъюгатов лизиновых дендримеров позволило впервые определить сходство и различие этих двух вариантов синтеза полиглутаминовых конъюгатов лизиновых дендримеров.
Известно, что эффективность действия биологически активных веществ может быть значительно усилена в результате их связывания с полимерными носителями. В ходе поиска полимерных носителей для направленного транспорта ДНК были выявлены определенные преимущества дендримеров [1—7]. Ранее с целью оптимизации ДНК-связывающих и ДНК-трансфецирую-щих свойств лизиновых дендримеров нами были получены и изучены "звездообразные" полимерные конъюгаты лизиновых дендримеров, в которых поли-М-винилимидазольные и полилизино-вые полимерные цепи были одноточечно связаны с аминогруппами М-концевых лизиновых остатков лизиновых дендримеров [4]. Оказалось, что способность компактизовать ДНК у звездообразных полилизиновых конъюгатов лизиновых дендримеров была значительно выше, чем у исходного лизинового дендримера. Аналогично в работе [8] на примере полиамидоаминного дендримера было показано, что его "звездообразный" полиглутаминовый конъюгат имеет явные преимущества по сравнению с исходным дендриме-ром для обеспечения действия связанного с ним низкомолекулярного противоракового соедине-
1Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (коды проектов 04-03-33032 и 07-03-00290).
E-mail: gpvlasov@km.ru (Власов Геннадий Петрович).
ния. Однако до настоящего времени практически ничего не известно о влиянии условий получения полиаминокислотных конъюгатов дендримеров на их структуру и свойства. В настоящей работе на примере синтеза полиглутаминовых конъюга-тов лизиновых дендримеров третьей—пятой генераций впервые сделана попытка рассмотреть данную проблему. С этой целью мы изучили особенности синтеза полиглутаминовых конъюгатов лизиновых дендримеров при проведении полимеризации М-карбоксиангидрида у-бензилглута-мата на аминогруппах М-концевых лизиновых остатков лизиновых дендримеров разного номера генерации в гомогенных (синтез конъюгатов в растворе) и гетерогенных условиях (синтез конъюгатов в полимерном геле). В последнем случае рассмотрено также влияние на строение полипептидных конъюгатов не только номера генерации дендримеров, но и емкости полимерного носителя по дендримерному инициатору.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реактивы
В работе использовали Ма,£-ди-трет-бутилок-сикарбониллизин (ди-BOC-лизин), трифторук-сусную кислоту, у-бензилглутамат, 1-окси-бензтриазол, трифторметансульфокислоту, ди-изопропилкарбодиимид, тиоанизол, этандитиол, динитрофенил-(ЭМР)-производные аминокис-
2190
лот: ^-ЭМР-лизина, №-ЭМР-лизина, №-,№-ди-ЭМР-лизина и Ма-ВМР-глутаминовой кислоты ('Т1ика", Германия). Растворители, полученные из открытого акционерного общества "Век-тон" (Санкт-Петербург), очищали и сушили перед использованием.
Оборудование
При очистке полимеров с помощью гель-хроматографии использовали колонки, заполненные BioGel P2 (BIORAD Laboratories, США), детекцию проводили на спектрометре 2138 иукогё^. Аминокислотный анализ выполняли на анализаторе ААА Т339 М ("Microtechna"). Капиллярный электрофорез осуществляли на приборе "Анализатор капиллярный ионнный "Нанофор-01" производства Института аналитического приборостроения РАН (Санкт-Петербург).
Синтез
Синтез лизинового дендримера третьей генерации.
Синтез дендримера проводили по аналогии с работами [4, 9] на сшитом полимерном носителе — п-ме-тилбензгидриламинополистироле (Neosystem Laboratories, Франция), который обычно используют для синтеза пептидов, с применением систем BOC/три-фторуксусная кислота—диизопропилкарбодиимид/1-оксибензтриазол. Для полного деблокирования конечных продуктов — лизиновых дендримеров и поли-глутаминовых конъюгатов на их основе и снятия дендримеров и конъюгатов дендримеров с полимерного носителя использовали смесь трифторметанс-ульфокислоты с трифторуксусной кислотой.
Протокол синтеза лизинового дендримера третьей генерации. В синтезе на 1.5 г п-метилбензгид-риламинной смолы использовали следующий протокол: 1 — стадия присоединения первого (С-концевого) лизина: ди-ВОС-лизин (1.5 ммоль/л), диизопропилкарбодиимид (15 ммоль/л), 1-окси-бензтриазол (1,5 ммоль/л) в ДМФА (15 мл), время реакции 12 ч, промывка ДМФА (3 раза по 15 мл), промывка CH2Cl2 (2 раза по 15 мл); 2 — стадия деблокирования: 50% трифторуксусной кислоты в CH2Cl2 (2 раза по 15 мл в течение 3 мин), промывка CH2Cl2 (2 раза по 15 мл), 3 — стадия депротони-рования: смесь 10% триэтиламина в ДМФА (2 раза по 15 мл в течение 1 мин), промывка: ДМФА (3 раза 15 мл); 4 — стадия ацилирования: ди-ВОС-лизин (1.5 ммоль/л), диизопропилкарбодиимид (1.5 ммоль/л), 1-оксибензтриазол (1.5 ммоль/л) в ДМФА (15 мл), время реакции 12 ч; 5 — нингид-риновый тест: промывка ДМФА (2 раза по 15 мл),
СН2С12 (2 раза по 15 мл). При неполной конденсации (наличии положительной нингидринной реакции) протокол повторяли с этапа 4.
Анализ полноты ацилирования (нингидриновый тест). Использованные реагенты: 6%-ный раствор нингидрина в этаноле, раствор фенола в этаноле (80 г фенола в 20 мл спирта) и пиридин (20 мл).
В пробирку к 1—2 мг пептидилполимера добавляли по 2 капли каждого реагента. Смесь нагревали 4—5 мин на кипящей водяной бане. При отсутствии положительной реакции на первичную аминогруппу (желтый раствор и бесцветная смола) синтез продолжали дальше. При проявлении синей окраски смолы и(или) раствора стадию ацилирования повторяли.
Снятие защитных групп с дендримера и его удаление с полимерного носителя (для проведения синтеза конъюгатов в растворе). В круглодонную колбу с магнитной мешалкой помещали 1.8 г дендри-мер-полимера, 18 мл трифторуксусной кислоты, 1.8 мл трифторметансульфокислоты и 1.8 мл тио-анизола. Смесь перемешивали 0.5 ч при 0°С и затем 1 ч при комнатной температуре. Полимер фильтровали и деблокированный дендример высаживали в 100 мл сухого серного эфира. Выпавший дендример фильтровали, промывали 3 раза порциями серного эфира по 20 мл, переосаждали растворением в 10 мл трифторуксусной кислоты и высаживанием в 100 мл сухого серного эфира, фильтровали и подвергали гель-хроматографической очистке.
Очистка дендримера с использованием гель-хроматографии. Дендример растворяли в 4 мл 6%-ной уксусной кислоты и наносили на колонку (60 х 2.5 см), заполненную Сефадексом G-10. Подвижной фазой служила 6%-ная уксусная кислота. Выход дендримера контролировали с помощью УФ-детекции на волне 254 нм. Соответствующую фракцию лиофилизовали. В случае синтеза полиглутаминовых конъюгатов лизиновых денд-римеров в растворе (синтез конъюгатов в растворе) дополнительную очистку дендримеров третьей, четвертой и пятой генераций проводили с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Supe1co (25 х 2.12 см) с сорбентом С-18 с использованием градиентного режима: элюент — смесь вода-аце-тонитрил-0.1%-ная трифторуксусная кислота. Поток 10 мл/мин. Градиент элюирующей системы 0-25%, время хроматографии 25 мин. Детектирование осуществляли при длине волны 230 нм. Время удерживания дендримеров третьей, четвертой и пятой генераций 18, 20 и 22 мин соответственно. Чистоту продуктов оценивали с исполь-
зованием аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Мис1ео811 (250 х 4.6 мм), сорбент С-18, поток 1 мл/мин (табл. 1). Аналогично были получены лизиновые дендримеры четвертой и пятой генерации.
Синтез полиглутаминового конъюгата в растворе при полимеризации ^карбоксиангидрида у-бен-зилового эфира глутаминовой кислоты на аминогруппах лизинового дендримера третьей генерации.
Синтез осуществляли по схеме
0=С-0-СН2С6Н5 (СН2)2 КНСН^О
I
(0 = С-
0
я
0=С_0-СН2С6Н5
СР3-803Н
(СН2)2
-(С-СН-КН)„— Н
О
0=С~0Н***
(СН2)2
-(-С-СН-КН)- Н, О
я
где R =
Я = МН, (синтез в растворе),
.Я = я-метилбензгидриламинополистирол (синтез в полимерном геле);
* М-карбоксиангид-
рид (гамма-бензил)-глутамата, ** = (гамма-бензил)-глутамат, *** = полиглутаминовая кислота.
Дендример третьей генерации (29 мг) растворяли в 30 мл ДМФА и депротонировали смолой 1ЯА-400 (НОформа). К раствору прибавляли М-карбоксиангидрид у-бензилглутамата (4.6 г), полученного из №-карбобензокси^-лизина и трифосгена согласно [10]. Реакционную смесь выдерживали пять дней, затем полиглутамино-вый конъюгат лизинового дендримера высаживали в диэтиловый эфир. Получили 580 мг конъюгата поли-(у-бензилглутамат)—лизиновый дендример. Снятие защитных групп с конъюгата проводили по аналогии с процедурой, описанной для деблокирования исходных лизиновых дендри-меров (см. выше). Получили 280 мг конъюгата поли-
Таблица 1. М-Концевой анализ а
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.