БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 1, с. 134-139
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 576.3
ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НАНОЧАСТИЦ КРИСТАЛЛИЧЕСКОГО КРЕМНИЯ in vitro
© 2014 г. А.Н. Шубенков, С.Б. Коровин*, Е.Р. Андреева, Л.Б. Буравкова, В.И. Пустовой*
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр РФ Институт медико-биологических проблем РАН, 123007, Москва, Xорошевское шоссе, 76а
E-mail: Ъигаукоуа@тЪр.ги *Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 38 E-mail: рш1оуоу @nsc.gpi. ru Поступила в p едакцию 25.06.13 г. После доработки 03.09.13 г.
И сследовано влияние наночастиц на основе кремния на жизнеспособность и состояние органелл культивируемых лимфоцитов периферической крови человека. Не выявлено изменений в количестве живых клеток по отношению к контролю. Гибель клеток происходила в основном за счет апоптоза и позднего апоптоза, а соотношение путей клеточной гибели в контроле и при инкубации с наночастицами оставалось неизменным. Все исследованные наночастицы на основе кремния (Si, SiB, SiPd) вызывали увеличение количества активных форм кислорода в клетках. Оценка изменений митохондрий и лизосом позволяет предположить, что модификация наночастиц незначительно снижает их биосовместимость.
Ключевые слова: наночастицы кремния, цитотоксичность, мононуклеары периферической крови человека.
Наночастицы на основе кремния привлекают внимание исследователей благодаря высо-кой степени биосовместимости [1], возможности модификации их поверхности различными функциональными гр уппами, большей стабильностью и повышенной интенсивностью свечения по сравнению с органическими полимерными матрицами и органическими флуоресцентными зондами [2]. В случае полых наночастиц их внутреннее содержимое защищено от внешних воздействий, в частности кислорода [3]. Наночастицы кремния могут быть использованы в медицине и биологии для направленного транспорта лекарств [1], в качестве оптических меток при диагностике и возможной терапии онкологических заболеваний. Благодаря низкой цитотоксичности, кр емниевые нано-частицы могут быть идеальными кандидатами для биологического флуоресцентного картиро -вания [4].
Сокращения: МНК - мононуклеары периферической крови, ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия, АФК - активные формы кислорода, СИФ - средняя интенсивность флуоресценции.
Достоинства исследованных в данной работе наночастиц со стоят в том, что наночастицы чистого кристаллического кр емния способны к флуоресценции и, таким образом, могут быть использованы в качестве биологических зондов. Наночастица перспективны для бор-нейтрон-захватной терапии [5,6]. Бор в виде наночастиц позволит реализовать адресную доставку и повысить эффективность воздействия на клетки-мишени. Для палладия особенно важно то, что он используется как катализатор различных химических реакций [7].
Активно разрабатываются методы синтеза кремниевых наночастиц с ковалентно присоединенными различными молекулами на поверхности. П ри этом стоит отметить, что различные типы поверхностной модификации потенциально способны придавать ту или иную степень токсичности данным наноматериалам [4]. В итоге мы имеем дело с практически бесконечным числом разновидностей «интерфейсов» между наночастицами и биологическими объектами, поскольку наночастицы отличаются не только геометрическими параметрами, но и физико-химическими и кристаллическими свойствами [8]. В связи с этим о собое значение приобр етает
исследование механизмов этих взаимодействий, что необходимо для успешного дизайна нано-материалов в будущем.
В настоящее вр емя имеется большое количество работ, посвященных изучению наноча-стиц на основе оксида кремния (silka) [9-11] и пористого кр емния [12]. Однако статьи, посвященные изучению наночастиц чистого кристаллического кремния, описывают их физико-химические свойства, необходимые для биотехнологии, но не затрагивают проблемы биосовместимости с живыми объектами [13,14].
Для тестирования кремниевых наночастиц были выбраны мононуклеары периферической крови (МНК) человека, поскольку на организ-менном уровне независимо от пути поступления в организм, будь это контакт с кожей или инъекция в ткань или кровь, одной из основных клеточных систем, с которыми будут взаимодействовать наночастицы, - это клетки крови. Оценка in vitro влияния наночастиц на эти клетки позволяет охарактеризовать не только клеточные эффекты, но и возможный биомедицинский риск использования наночастиц на уровне организма.
Цель данного исследования состояла в оценке in vitro повреждающих эффектов наночастиц на основе кр емния (Si, SiB, SiPd) на мононук-леары периферической крови человека.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для получения кремниевых наночастиц использовали метод лазерного пиролиза, который отличается от всех других методов получения наночастиц, главным образом, своей чистотой. В реакторе нет никаких посторонних веществ, которые могли бы загрязнять получаемые частицы. К роме того, метод позволяет в широких пределах менять параметры реакции и получать частицы с заранее заданными параметрами, такими как размер, стр уктура, соотношение компонентов, состояние поверхности и др.
Синтез наноразмерного порошка кремния осуществляли в проточном реакторе в струе моносилана (Si^) (Хорст, Россия), окруженной цилиндрическим потоком буферного газа (аргон либо гелий). Реакция пиролиза индуциро -валась непрерывным излучением С02-лазера ИЛГН-802 с длиной волны X = 10,6 мкм, выходной мощностью 70 Вт и диаметром луча 6 мм. Сбор получившегося порошка осуществлялся по окончании реакции в блоке со сменными фильтрующими ячейками в атмосфере аргона [15,16]. Анализ размеров полученных наночастиц и их дисперсии по размерам с помощью просвечивающей электронной микро-
скопии (ПЭМ) показал, что суспензия наночастиц достаточно однородна и их диаметр со -ставляет в ср еднем 7 нм. П р оведенный анализ кристаллической структуры образцов с использованием дифракции электронов на кристаллической решетке позволил установить, что наночастицы имеют кристаллическую структуру кремния.
Для синтеза наночастиц, содержащих бор и кремний, проводили лазерный пиролиз смеси моносилана и трихлорида бора (ВС13) (Хорст, Ро ссия) [17]. С помощью ПЭМ было показано, что наночастицы имели сферическую форму со ср едним эффективным диаметром около 10 нм. И сследование полученных наночастиц методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии в трех произвольно выбранных точках обр азца показало наличие в спектре линий, соответствующих энергии связи 28-электронов кр емния (150-154 эВ) и 18-электронов бора (187 эВ).
Для экспериментов были выбраны наноча-стицы Б1В, содержащие около 20% бора, такие наночастицы сохраняли кр исталлическую р е-шетку кремния (кремний, легированный бором).
О саждение металлического палладия на поверхность наночастицы проводили в два этапа. Сначала производили пассивацию поверхности кремниевой наночастицы добавлением в водный коллоид небольшого количества плавиковой кислоты, которая удаляет атмосферный окисел кремния и создает на поверхности монослой водорода. Полученный коллоид промывали водой для удаления продуктов реакции, добавляли раствор хлористого палладия (Хо рст, Россия) и помещали в ультразвуковую ванну. Осаждение металлического палладия на поверхности наночастицы происходило за счет сильного локального поля на связи Б1-Н и интенсивного ультразвукового воздействия. Процентное содержание нанокремния и соли палладия рассчитывали так, чтобы толщина слоя составляла 5 нм. Реально полученная толщина слоя составила 2,5-3,0 нм.
Характеристика использованных наноча-стиц приведена в табл. 1.
Выделение мононуклеаров. Мононуклеары получали из периферической крови здоровых доноров (п = 5) методом центрифугирования в градиенте плотности Р1со11-Ш81юрадие (Б1§ша-АЫпсЬ, США), как было описано ранее [18].
Культивирование. МНК культивировали 24 ч в ср еде ИРМ1 1640 (Биолот, Россия), содержащей 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия), 2 мМ глута-мина (ПанЭко, Россия) и 5% ЭТС (НуС1опе, США) в концентрации 1-106 кл/мл в С02-инку-
Таблица 1. Параметры наночастиц
Тип частиц Диаметр, нм ^руктура Pаcтвоpитель Исходная концентрация, мг/мл
Si 7 Кристаллическая р ешетка типа алмаза H2O 10
SiB 10 Кристаллическая р ешетка типа алмаза H2O 10
SiPd 15 Кристаллическая р ешетка типа алмаза H2O 1
баторе (Sanyo, Япония) при 37°C в атмосфере 5% CO2, 95% воздуха и 100% влажности.
Концентрация исходной суспензии наночастиц Si и SiB со ставляла 10 мг/мл, концентрация наночастиц SiPd - 1 мг/мл. Наночастицы добавляли в ср еду культивир ования в концентра -ции 1, 10 и 100 мкг/мл. Клетки, инкубировавшиеся в ср еде, не содержащей наночастиц, были использованы в качестве контроля для определения исходных значений изучаемых показателей.
Оценка жизнеспособности МНК, характеристика трансмембранного потенциала митохондрий, состояния лизосомального компартмента и продукции активных форм кислорода. Цитоток-сичность наночастиц определяли в суспензии с помощью набора ANNEXIN V - FITC Kit (ImmunoteA, Франция) согласно инструкции фирмы-производителя по стандартной методике совместно с окрашиванием йодидом пропидия на пр оточном цитофлуориметр е Ер^ XL (Вес-kman Coulter, США). Определяли долю живых клеток (Annexin V-/PI-), апоптотических клеток (Annexin V+/PI-), некротических клеток (Annexin V-/PI+) и клеток в состоянии постапоптоти-ческого некроза ^п^хш V+/PI+).
Т рансмембранный потенциал митохондрий характеризовали при помощи флуоресцентного зонда Mito Tracker red FM (Авозб = 581 нм, Аисп = 644 нм) (Invitrogen, CША/). Данное вещество пассивно проникает через клеточную мембрану и аккумулируется в активных митохондриях, а интенсивность его флуоресценции отражает состояние трансмембранного потенциала.
Cоcтояние лизосомального компартмента оценивали при помощи рН-чувствительного флуоресцентного зонда Lyso Tracker Green DND 26 (Авозб = 504 нм, Аисп = 511 нм) (Invitrogen, ОТА).
Активные формы кислорода (АФК) в клетках выявлял
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.