БИОФИЗИКА, 2012, том 57, вып. 5, с. 746-750
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА ==
УДК 577.3
ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ПРОИЗВОДНЫХ ФУЛЛЕРЕНА С60
© 2012 г. А.Г. Бобылёв*, А.Д. Окунева* **, Л.Г. Бобылёва*, И .С. Фадеева*, P.C. Фадеев*, Н.Н. Салмов*, З.А. Подлубная* **
*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Pоссийской академии наук, 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3;
E-mail: bobylev7@rambler.ru **Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290, Пущино Московской области, просп. Науки, 3 Поступила в p едакцию 18.06.12 г.
И сследована цитотоксичность производных фуллерена Сбо на культуре клеток НЕр-2. Показано, что комплексы фуллерена Сбо с поливинилпирролидоном (м.м. поливинилпирролидона 25000 и 10000), Сбо^й2-пролин и Сбо-аланин не оказывают цитотоксического действия, в то время как натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена Сб0 обладает выраженным токсическим действием на исследованную культуру клеток, что исключает ее использование на биологических объектах.
Ключевые слова: фуллерены, цитотоксичность, производные фуллерена С^о.
Фуллер ены - молекулярные соединения, принадлежащие к классу аллотропных форм углерода и представляющие собой полициклические структуры сферической формы, состоящие из атомов углерода, связанных в шести-и пятичленные циклы. Первоначально возможность существования структур ы, со стоящей из 60 углеродных атомов (фуллерена Сб0), была обоснована теоретически [1]. Открытие фулле-ренов принадлежит Крото и Смолли [2], которые, используя лазерную лучевую установку, зафиксировали особую стабильность С60 и С70, а затем предложили пер вые структурные изображения этих молекул.
Наиболее распространенный представитель семейства полиуглеродных кластеров - фуллерен С60 - получил название бакминстерфуллерен (рис. 1). Фуллерен С60 - это электроотрицательная молекула, которая может быть легко восстановлена, но окисляется с трудом. Поэтому основными типами реакций являются нуклео-фильное, радикальное или цикло-присоединения [3-6]. Так как молекула электрофильна, то она является сильным акцептором электронов и свободных радикалов. По этой причине фуллерены были даже названы «радикальными губками» [7]. Помимо сильных антиоксидантных свойств у фуллеренов были открыты другие биологические свойства: ингибирование протеазы ВИЧ-1, фотомодификация ДНК, нейропротекция и т.д. [810]. Фуллерены нерастворимы в полярных рас-
творителях, поэтому для изучения их биологических свойств используются стабильные коллоидные растворы фуллеренов в воде [11], не-ковалентные комплексы фуллеренов с гидрофильными органическими молекулами, в том числе с полимерами (например, комплексы фуллерена С60 с поливинилпирролидонами и циклодекстринами), а также синтезированные водорастворимые производные фуллеренов.
Первые эксперименты по изучению биологических свойств фуллеренов были направлены на исследование их токсикологических характеристик. Изучалось действие коллоидных растворов фуллер ена С60 на рост 22 р азличных микробных линий. При этом не было обнаружено отрицательного действия фуллерена на рост бактерий. Такие же результаты были получены при исследовании токсичности в опытах на культурах человеческих моноцитов, лейкоцитов и макрофагов [12]. Однако существуют данные, свидетельствующие о токсичности фул-леренов для организмов животных для различных клеточных культур [13-17].
В данной работе мы проводим сравнительное исследование токсического действия комплексов фуллерена С60 и водорастворимых про -изводных фуллер ена С60 на культуру клеток карциномы гортани человека НЕр-2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальный материал. Комплексы фуллерена Сбо с поливинилпирролидоном с молекулярными массами ПВП 10000 и 25000 и содержанием в них фуллерена 0,5-0,6%, полученные по методу [18], предо ставлены Л .Б. Пиотровским из Института экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург; натриевая соль поликарбоксильного производного фулле-рена Сб0, полученная по методу [19], предоставлена П .А. Тр ошиным из Института пр облем химической физики РАН, Черноголовка, Россия; Сб0-К02-пролин, Сб0-(К02)2-пролин, Сб0-К02-пролин-К02 и Сб0-аланин предо ставлены Р.А. Котельниковой из Института проблем химической физики Р АН, Чер ноголовка, Ро ссия.
Исследование клеточной токсичности производных фуллерена C60. Клетки кар циномы гортани человека НЕр-2 выр ащивали в ср еде ДМЕМ (ср еда Игла, модифицированная Дуль-бекко) с добавлением 10% FBS, 40 мкг/мл ген-тамицина, 2,1 г/л бикарбоната натрия при 37°С и в атмосфере 5% СО2. И сследуемые вещества добавляли в среду через 24 ч после посева клеток (50 тыс. кл./мл).
Цитотоксическое действие веществ оценивали по окраске кристаллическим фиолетовым [20]. Клетки высевали на 9б-луночные микро-планшеты и через 1 сут после посева добавляли комплексы фуллерена Сб0 с поливинилпирро-лидоном и поливинилпирролидон с молекулярными массами 10000 и 25000, а также фулле-ренол и натриевую соль поликарбоксильного производного фуллерена Сб0. Количество живых клеток определяли по отношению количества живых клеток в опытных и контрольных (необработанных исследуемыми веществами) культурах после 48 ч инкубирования. Цитоток-сический эффект оценивали по отношению разности между оптической плотностью в опыте и фоном к разности между оптической плотностью в контроле и фоном. Оптическая плотность была пропорциональна количеству живых клеток. Измерение проводили с использованием планшетного спектрофлуор иметра Infinite F200 (Тесап, Австрия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее мы показали, что фуллер ен Сб0 и ряд его производных способны разрушать амилоидные фибриллы А в(1-42)-пептида мозга, участвующего в патогенезе болезни Альцгеймера, а также мышечного X-белка [21-25]. Из полученных результатов был сделан вывод, что фул-лерен Сб0 и его производные можно рассмат-
Рис. 1. Бакминстерфуллерен или букибол (кратко фуллерен С60).
ривать как потенциальные антиамилоидные вещества. П ри этом все исследованные производные фуллерена С60, кр оме натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена С60 (рис. 2), не оказывали разр ушающего действия на фибр иллы мышечного актина [26]. Полученные результаты свидетельствуют об избир атель-ной способности фуллерена С60 и его производных р азр ушать патологические амилоидные фибр иллы, не нарушая структуры фибрилл о с-новного сократительного белка актина. Однако исследования цитотоксичности данных производных фуллер ена С60 не проводились. В этой работе мы провели исследование цитотоксич-ности исследованных производных фуллерена Сб0, в том числе и натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена С60 (рис. 2), на культур у клеток НЕр-2.
В качестве объекта исследования цитоток-сического действия фуллер ена Сб0 и его про -изводных была выбрана культура клеток карциномы гортани человека НЕр-2. Эта линия широко используется в качестве модели при различных исследованиях на клеточных культур ах, так как она не требует сложных сред, обладает четким митотическим индексом и на вторые-третьи сутки образует монослой.
Мы показали, что комплексы фуллер ена Сб0 с поливинилпирролидоном (м.м. поливинил-пирролидона 25000 и 10000) не оказывали токсического действия на культуру клеток НЕр-2 (рис. 3). В этой культуре клеток наблюдалась их 100% выживаемость при добавлении как комплексов фуллерена Сб0 с поливинилпирро -лидоном, так и самого полимера поливинил-
748
БОБЫЛЁВ и др.
Р ис. 2. С труктур а: (а) - натр иевой соли поликар боксильного пр оизводного фуллер ена С60; (б) - комплексов
С60-М02-пролина; (г) - С60-(М02)2-пролина; (д) - С60-М02-про -
фуллер ена С60 с поливинилпирролидоном; (в) лин-М02; (е) - С60-аланина.
пирролидона с молекулярными массами 25000 и 10000 в диапазоне концентраций 0,016-2,0 мг/мл (данные не пр едставлены).
Рис. 3. Исследование цитотоксического действия: 1 - комплекса фуллер ена С60 с поливинилпирро -лидоном (м.м. поливинилпирролидона 10000); 2 -комплекса фуллер ена С60 с поливинилпирролидоном (м.м. поливинилпирролидона 25000).
И сследование цитотоксичности С60-аланина и С60-№02-п р олина также показало отсут ствие у них токсического действия на исследуемую культуру клеток в диапазоне концентр аций 0,016-2,0 мг/мл для С60-аланина (р ис. 4) и 0,0010,2 мг/мл для С60-№02-пролина (рис. 5).
Натриевая соль поликар боксильного пр оизводного С60 оказывала выр аженное токсическое действие на исследуемую культуру клеток в диапазоне концентр аций 0,016-2,0 мг/мл (рис. 6), что наряду с данными по разрушающему действию на мышечный актин исключают ее из списка потенциальных антиамилоидных веществ.
Нам не удало сь и сследовать токсичность у С60-(К02)2-п р олина и С60-№02-п р олин-№02. Это связано с их способностью образовывать, по данным электронной микроскопии [24], крупные (до 200 нм и более) и нер аствор имые агрегаты, что сильно затрудняет исследование токсического действия этих производных фуллер ена С60 на клеточную культур у. С по собность
Pис. 4. Исследование цитотоксического действия Сбо-аланина.
Pис. 5. И сследование C60-N 02-пр о лина.
цитотоксического действия
P ис. 6. И сследование цитотоксического действия натр иевой соли поликар боксильного пр оизводного фуллерена С
-60.
фуллер енов агр егир овать также может пр епят -ствовать его выведению из ор ганизма.
Отсутствие токсичности у исследованных водор аствор имых пр оизводных фуллер ена С60 и его комплексов (С60-аланин, С60-№02-п р олин, комплексов фуллер ена С60 с поливинилпирро -лидоном) откр ывает перспективы для разр абот-ки на их основе безопасных терапевтических препаратов.
Р абота выполнена пр и финансовой под-дер жке программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», грантов Российского фонда фундаментальных исследований № 09-04-01161, № 10-04-00141 и гранта Федер альной целевой пр огр аммы «Научные и
научно-педагогические кадры инновационной Р о ссии», ГК № 02.740.11.0710 с и спользованием оборудования Центр а коллективного пользова -ния ИТЭБ РАН.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Д. А. Бочвар и Е. Г. Гал
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.