ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 6, с. 549-556
БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ
УДК 57.017.35-611.835.8
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АЛЛОТРАНСПЛАНТАТОВ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ЗАКЛАДОК СПИННОГО МОЗГА КРЫС НА РОСТ РЕГЕНЕРИРУЮЩИХ
ВОЛОКОН НЕРВА РЕЦИПИЕНТА
© 2014 г. Е. С. Петрова*, Е. Н. Исаева**
* НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, 197376 Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12 ** НИИ особо чистых биопрепаратов Федерального медико-биологического агентства России, 197110 Санкт-Петербург, ул. Пудожская, 7 E-mail: Iemmorphol@yandex.ru Поступила в редакцию 15.10.2013 г.
Проведено сравнительное исследование влияния тканевых и суспензионных аллотрансплантатов эмбрионального спинного мозга на регенерацию нервных волокон поврежденного путем наложения лигатуры седалищного нерва крысы. Показано, что в отличие от тканевых трансплантатов, достигающих через 21 и 60 сут после пересадки большого объема, суспензионные трансплантаты не препятствуют росту аксонов реципиента на периферию. Установлено, что введение в поврежденный седалищный нерв крыс суспензии диссоциированных клеток эмбриональных закладок спинного мозга, но не фрагментов этих закладок, через 60 сут после операции приводит к увеличению числа миелинизированных регенерирующих нервных волокон реципиента.
DOI: 10.7868/S0002332914060083
Достижения в области регенеративной нейро-биологии показали, что клеточная терапия может оказывать стимулирующее влияние на процессы репаративной регенерации органов нервной системы (Александрова и др., 2004; Угрюмов и др., 2004; Лосева и др., 2011; Ченцова и др., 2012; Яры-гин, Ярыгин, 2012). Одна из актуальных задач — поиск способов восстановления поврежденных нервов, который затрудняется как ограниченностью полного восстановления периферических нервов после традиционных способов лечения, так и недостатком фундаментальных знаний о молекулярных механизмах их регенерации. Для стимуляции регенерации поврежденных нервных проводников разрабатываются клеточные технологии с использованием стволовых клеток и эмбриональных закладок (Walsh, Midha, 2009; Xiong et al., 2009; Челышев, 2011).
Впервые пересадку эмбриональных закладок центральной нервной системы (ЦНС) в поврежденный нерв грызунов для улучшения его регенерации независимо друг от друга осуществили американские и канадские исследователи (Bernstein, 1983; Richardson, Issa, 1984; Doering, Aguayo, 1987). Основное внимание этих авторов было уделено изучению развития нейротрансплантатов, тогда как трофическое влияние трансплантатов на регенерацию поврежденного нерва не изучалось.
Ранее в Институте экспериментальной медицины в отделе морфологии, руководимом
чл.-корр. РАМН В.А. Отеллиным, изучались особенности гистогенетических процессов различных эмбриональных закладок крыс при пересадке в нерв. Было показано, что трансплантация эмбриональных закладок ЦНС — удобная модель для анализа реализации гистобластических потенций пересаженных клеток-предшественников в условиях измененного микроокружения. Были изучены процессы пролиферации и апоптоза пересаженных нейроэпителиальных клеток, описаны синаптогенез и миелинизация в нейротранс-плантатах, выявлены деструктивные изменения в длительно живущих трансплантатах, определены взаимоотношения пересаженных клеток с клетками нерва реципиента (Петрова, 2009). Однако морфологической оценки влияния пересаженных закладок на рост нервных волокон реципиента проведено не было.
Цель работы — сравнительное исследование влияния на регенерацию нерва реципиента трансплантации фрагментов эмбриональных закладок спинного мозга и диссоциированных клеток, полученных из этих закладок.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Были использованы крысы Вистар (п = 35), содержание которых и все эксперименты осуществляли с учетом правил проведения работ с использованием экспериментальных животных. Седалищные нервы крыс-реципиентов повреждали путем наложения лигатуры в течение 40 с на уров-
не верхней трети бедра. Рядом с местом повреждения со стороны проксимального сегмента нерва делали небольшой разрез (1 мм) эпи-невральной и периневральной оболочек. Через разрез под периневрий наиболее крупного нервного ствола осуществляли трансплантацию эмбрионального материала с помощью тонкой стеклянной канюли (диаметром 0.6 мм). Операцию проводили под микроскопом МБС-2. Донорами служили 15-суточные эмбрионы крыс, у которых выделяли фрагменты шейного отдела спинного мозга, содержащие нейральные стволовые/проге-ниторные клетки (НСПК). В первом эксперименте трансплантировали фрагменты эмбриональных закладок, во втором вводили взвесь клеток, полученную после диссоциации эмбрионального спинного мозга.
Для получения суспензии клеток выделенные эмбриональные закладки помещали в культу-ральную среду 199 (Биолот, С.-Петербург), содержавшую 0.2% химопсина ("Самсон-Мед", Россия), на 10 мин (37°С), затем фрагменты закладок пипетировали, взвесь клеток дважды отмывали средой без химопсина, центрифугируя в течение 15 мин (200 g). Осадок ресуспендировали в 1 мл свежей среды, и проводили тест на жизнеспособность клеток с помощью 0.2%-ного раствора три-панового синего и подсчета клеток в камере Горя-ева. Для трансплантации использовали суспензию клеток, если жизнеспособность последних была не менее 85%. Взвесь клеток (3—7 х 104) вводили в 5 мкл среды под периневрий нервного ствола с помощью той же канюли, что и в первом эксперименте.
Животных содержали в обычных условиях вивария и через 21 и 60 сут умерщвляли в парах этилового эфира. Проксимальные сегменты нервов, содержавшие трансплантаты, фиксировали в растворе цинк-этанолформальдегида (Коржевский и др., 2013). После обезвоживания материала в спиртах возрастающей концентрации и заливки в парафин изготавливали срезы толщиной 5 мкм.
В первом эксперименте гистологические препараты окрашивали гематоксилином-эозином и толуидиновым синим. Для выявления астроцитов использовали моноклональные антитела к гли-альному фибриллярному кислому белку (GFAP) (клон SPM507) (Spring BioScince, США).
Во втором эксперименте для идентификации в эндоневрии реципиента пересаженных клеток проводили иммуногистохимическое выявление нейронального ядерного антигена NeuN моно-
клональными мышиными антителами (клон А60; Chemicon, США) в разведении 1 : 400. В качестве вторичных реагентов использовали реактивы из набора EnVision+System Labbeled Polymer-HRP Anti-Mouse (K4001) (Dako, Дания). Для количественной оценки регенерации нервов выделяли их дистальные сегменты на расстоянии 0.5 см от места наложения лигатуры. Материал фиксировали в 2.5%-ном растворе глутарового альдегида, дофиксировали в 2%-ном растворе четырехокиси осмия, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и пропиленоксиде и заливали в эпон. После этого изготавливали полутонкие срезы и окрашивали их толуидиновым синим.
Анализ числа миелинизированных регенерирующих аксонов осуществляли методом, описанным в работах, где оценивали регенерацию нервов после их повреждений (Heine et al, 2004; Gravvanis et al., 2005). Количественный анализ регенерирующих нервных волокон нерва проводили на цифровых изображениях, полученных с помощью микроскопа Leica DM 750 (Германия) и цифровой камеры Leica ICC 50. Подсчитывали число миелинизированных нервных волокон на расстоянии 0.5 см дистальнее места наложения лигатуры. Подсчет проводили при увеличении х1000 на шести полях зрения площадью 12884 мкм2 с пересчетом на 1 мм2. Для подсчета использовали программу ImageJ (NIH, США). Различия определяли с помощью t- и ^-критериев приp < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Гистологический анализ поперечных полутонких срезов седалищного нерва крыс на уровне верхней трети бедра показал, что основная часть интактного нервного ствола состоит из нервных волокон с хорошо развитой миелиновой оболочкой (рис. 1д). Диаметр наиболее крупных из них составляет 12—14, толщина их миелиновых оболочек — 2.3 мкм. Плотность нервных волокон на единице площади составляет 8300.9 ± 560.2 на 1 мм2 (n = 6). Нервные волокна располагаются в эндо-неврии достаточно плотно, пространства, заполненные соединительно-тканными элементами, невелики. Между волокнами наблюдаются фиб-робласты, клетки кровеносных сосудов, коллаге-новые волокна.
Сегменты седалищных нервов экспериментальных крыс анализировали через 21 и 60 сут после операции. Эти сроки оптимальны для количественной оценки миелинизированных регенери-
Рис. 1. Миелинизированные нервные волокна на поперечном срезе седалищного нерва крысы. а — через 21 сут после наложения лигатуры, б — через 21 сут после наложения лигатуры и трансплантации фрагмента эмбрионального спинного мозга, в — через 60 сут после наложения лигатуры, г — через 60 сут после наложения лигатуры и введения диссоциированных клеток эмбрионального спинного мозга, д — в интактном нерве. Полутонкие срезы — окраска толуидиновым синим. Масштаб: 10 мкм.
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АЛЛОТРАНСПЛАНТАТОВ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ЗАКЛАДОК
э ** сШ
О О
* ) * Ак т д
Ш ' »О« А (>
^«р о™ * и | V
, о» ¿5* Р А Ш
(а) , •
" »^ёййж а
л > я» <
)Пя |О вОс ОР ° V
в)
О 42© О
(г)
_,
(д)
Изменение числа миелинизированных нервных волокон в нерве крысы после экспериментальных воздействий
Эксперимент Срок наблюдения, сут Число животных Число миелинизированных волокон (на 1 мм2)
Наложение лигатуры 21 8 6773.4 ± 446.3
Наложение лигатуры, трансплантация фрагментов эмбриональных закладок спинного мозга 21 4 2119.6 ± 200.2*
Наложение лигатуры,введение диссоциированных клеток эмбрионального спинного мозга 21 4 8127.6 ± 480.3
Наложение лигатуры 60 8 13621.0 ± 797.1*
Наложение лигатуры, введение диссоциированных клеток эмбрионального спинного мозга 60 5 18161.8 ± 2140.6**
* р < 0.05 по сравнению с наложением лигатуры через 21 сут. ** То же через 60 сут.
рующих аксонов. В более ранние сроки (в течение 2 нед) в поврежденном нерве происходят сложные дегенеративно-регенеративные процессы (Waller, 1852; Ноздрачев, Чумасов, 1999). В ди-стальном его конце наблюдается валлеровская дегенерация: большая часть аксонов погибает после повреждения, а их миелиновые оболочки подвергаются распаду и фагоцитируются макрофагами.
Сле
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.