БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ
УДК [57+61]::539.1.04:599.323.4::539.1.074:591.11:591.111.1
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НИЗКОДОЗОВОГО у-ОБЛУЧЕНИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЭРИТРОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ КРЫС © 2014 г. О. С. Изместьева*, А. А. Лузянина, И. Л. Ершова, Л. П. Жаворонков
Медицинский радиологический научный центр Министерства здравоохранения Российской Федерации, Обнинск
Низкоинтенсивное у-излучение с мощностью поглощенной дозы (МПД) 4 мкГр/мин является стрессогенным фактором средней силы. При накопленной дозе 4.8 мГр у самцов-крыс линии Ви-стар в системе красной крови возникают выраженные и длительно сохраняющиеся реакции. Функциональный дефицит циркулирующих клеток оценивали по устойчивости эритроцитов к кислотному гемолитику и активности основных ферментов антиоксидантной системы — супероксиддисму-тазы (СОД) и каталазы (КАТ). В работе делается вывод, что минимальные "пороговые" дозы облучения, вызывающие системные реакции, находятся в диапазоне единиц миллигрей.
Малые дозы радиации, цитопения, эритроциты, функциональная неполноценность. БО1: 10.7868/80869803114050063
Последствия хронического воздействия у-из-лучения низкой интенсивности на систему крови изучаются достаточно широко. Показано, что длительное пребывание людей на радиоактивно-загрязненных территориях приводит к цитопе-нии всех популяций клеток периферической крови [1, 2]. При этом средний уровень суммарной поглощенной дозы, приходящейся на костный мозг, авторы работы [3] определяют близким к 330 мГр. В опытах на собаках с применением методов математического моделирования удалось характеризовать уровень поглощенных доз до 100 мЗв/сут как предел устойчивости для системы клеточного обновления гемопоэтических клеток [4]. В качестве возможного механизма гемотокси-ческого действия ионизирующей радиации с относительно невысокой мощностью поглощенной дозы 16 сГр/сут в условиях хронического воздействия рассматривается нарушение кинетики, пролиферативного и дифференцировочного потенциала стволовых кроветворных клеток [5]. Другими авторами установлено, что у-излучение с мощностями доз 0.625—10 мкГр/с в суммарных дозах 2 и 4 Гр приводит к повышению пролифера-тивной активности клеток костного мозга с увеличением числа миелокариоцитов, находящихся в ¿-периоде клеточного цикла [6, 7].
* Адресат для корреспонденции: 249036 Обнинск, Калужская обл., ул. Королева, 4, ФГБУ МРНЦ Минздрава России; тел.: (48439) 9-71-38; факс: (495) 956-14-40; e-mail: ol-gaizmestieva@mail.ru.
В качестве дополнительной мишени, на которую воздействует ионизирующее излучение низкой интенсивности, можно рассматривать антиоксидант-ную систему организма. В ряде публикаций показано снижение общей антиокислительной активности эритроцитов и сыворотки крови у лабораторных мышей как при длительном воздействии у-излуче-ния с мощностью поглощенной дозы 1—16 сГр/сут [8], а также у мышей-полевок, обитающих в регионах с повышенным радиационным фоном [9] при суточном воздействии в дозе 15 сГр [10].
Последствия хронического низкоинтенсивного воздействия ионизирующей радиации могут сохраняться долгое время, практически до конца жизни, как это показано по изменению в распределении миелокариоцитов по фазам клеточного цикла с увеличением их количества в фазе синтеза ДНК [7].
В большинстве представленных работ проводится анализ последствий воздействия ионизирующего излучения низкой интенсивности при накоплении сравнительно больших доз облучения. Нижняя же граница "порога" системных реакций на воздействие радиации в малых дозах надежно не определена. Исходя из вышеизложенного, вопрос о существовании детерминистических эффектов низкоинтенсивного воздействия у-излучения в малых и сверхмалых дозах остается актуальным с научной и практической точек зрения.
В связи с этим нами проведено исследование функционального состояния эритроцитов периферической крови самцов-крыс после пролонги-
рованного воздействия у-радиации в диапазоне доз, немногим превышающем естественный радиационный фон.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Реакцию организма животных на воздействие ионизирующей радиации оценивали по следующим тестам: а) устойчивость мембран эритроцитов периферической крови к изменению рН (метод кислотных эритрограмм); б) оценка состояния ферментного комплекса антиоксидантной системы (АОС) по активности двух ферментов цельной крови — супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ).
В опытах использованы 142 крысы самцов линии Вистар с массой тела 200—230 г в возрасте 2.5—3.0 мес. Животных содержали в условиях вивария при комфортных климатических условиях и стандартном рационе питания на основе сбалансированных брикетированных кормов. Все работы с животными выполняли в соответствии с рекомендациями документа [11].
Пролонгированное облучение крыс проводили на установке панорамного типа "Эксперимент" (Россия) с источником у-излучения 137Cs в четырех режимах воздействия. При первом режиме в условиях непрерывного воздействия в течение 20 ч суммарная поглощенная доза составила 4.8 мГр при мощности поглощенной дозы 4 мкГр/мин. Второй режим воздействия — четырехкратное облучение по 5 ч ежедневно при сохранении той же мощности и суммарной дозы облучения (4 мкГр/мин и 4.8 мГр, соответственно). Длительность перерыва между фракциями составила 19 ч. Третью подопытную группу составили животные, подвергнутые действию ионизирующего излучения в дозе 3.3 сГр при МПД 27.5 мкГр/мин. В качестве группы сравнения — четвертый режим — были использованы крысы, получившие минимально возможный в наших условиях уровень воздействия, который был на порядок ниже — 0.48 мГр за 20 ч в непрерывном режиме. Дозиметрические измерения проводили клиническим дозиметром типа 27012 ("Veb RFT Messellktronik "Otto Schon"", Германия). Доверительный интервал погрешности измерения при вероятности 0.95 не превышает 9%. Мощность экспозиционной дозы определяли непосредственно в каждой клетке, где размещали животных на период облучения. Число животных в экспериментальных группах составляло 30—45 с учетом неоднократных повторностей. В представленной работе в качестве примера приводятся результаты по одному эксперименту.
Анализ кислотоустойчивости мембран эритроцитов и активности ферментного звена анти-оксидантной системы цельной крови у одних и тех же крыс проводили до воздействия, а также в разные сроки после окончания облучения путем спектрометрии лизатов суспензий клеток на спектрофотометре "UNICO 2804" (США). Взятие крови производили из хвостовой вены, с предварительной гигиенической обработкой поверхности хвоста ватным тампоном, смоченным теплой водой. Максимальный объем разовой кровопоте-ри каждого животного из всех исследованных групп не превышал 250 мкл, что составляет менее 3% от объема циркулирующей крови у животных с массой тела 230 г.
Методика определения и анализа эритрограмм. Для определения кислотной стойкости эритроцитов 40 мкл крови, взятой у крыс из хвостовой вены, разводили в 4.5 мл физиологического раствора [12, 13]. Разведенную кровь смешивали с равным объемом 0.004 моль/л HCI на физиологическом растворе, помещали смесь в термостати-руемую при 25°С кювету спектрофотометра и каждые 30 с регистрировали экстинкцию смеси при 670 нм, определяя таким образом ход гемолиза эритроцитов под действием 0.002 моль/л HCI. На основании полученных данных с применением компьютерной программы рассчитывали кинетики гемолиза и строили дифференциальные эритрограммы, показывающие, какой процент эритроцитов распадается за каждую полуминуту. Значения этого показателя (%) умножали на время от начала гемолиза (мин), сумма этих произведений за весь период гемолиза дает интегральный показатель — суммарную стойкость эритроцитов (Р). Используя данные компьютерной обработки изменения экстинкции смеси эритроцитов и данные эритрограмм (рисунок), регистрировали дополнительно еще и такие показатели как:
— время max гемолиза или максимум основного пика эритрограммы, который, как видно из рисунка, приходится на 4.5 мин;
— % молодых эритроцитов, лизис которых приходится на время после 7.5 мин (определяется по распечатке);
— время пологого пика — время пика гемолиза молодых эритроцитов;
— общее время гемолиза эритроцитов.
Методика определения активности каталазы.
Активность каталазы в гемолизированной крови определяли спектрофотометрически общепринятым методом при длине волны 420 нм, принцип которого основан на способности перекиси водорода образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс [14]. Активность ка-
Кинетика гемолиза эритроцитов периферической крови крыс: 1 — время максимума гемолиза основной части эритроцитов; 2 — время начала гемолиза молодых эритроцитов; 3 — время максимума пологого пика; 4 — общее время гемолиза. По оси ординат — х I , где — процент распавшихся на г-полуминуте эритроцитов, а I ^ — время, прошедшее от начала гемолиза.
талазы эритроцитов выражали в количестве утилизированной перекиси водорода в пикакаталях (мкмоль за 1 мин из расчета на один эритроцит), пкат/эритроцит. С этой целью гемолизат крови разводили таким образом, чтобы в реакционную смесь попадало 106 эритроцитов.
Определение активности супероксиддисмутазы. Активность СОД в гемолизате крови оценивали спектрофотометрическим методом при длине волны 420 нм, основанном на торможении СОД аутоокисления кверцетина, вызванным анион-
радикалом (Oj) [15]. Полученные результаты выражали в пг очищенного фермента — на 1 эритроцит [16].
Полученный цифровой материал обрабатывали с применением методов вариационной статистики — i-критерий Стьюдента, статистически значимые различия между опытными и контрольными группами принимали при значении интеграла вероятности, не превышающем 0.05. Статистический анализ проводили с помощью программы Origin 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Пролонгированное воздействие у-излучения в низких дозах (мощность дозы 4 мкГр/мин в общей дозе 4.8 мГр) в условиях непрерывности облучения (20 ч) вызывало у животных при сравнении с исходным уровнем однонаправленные из-
менения, максимальная выраженность которых регистрируется в конце первых трех суток. Из ре
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.