УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2007, том 127, № 5, с. 452-457
УДК 576.858+578.1+547.963.1.02.
ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛЕКТИНОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МОРСКИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ, С ВИРУСАМИ РАСТЕНИЙ И ЧЕЛОВЕКА
© 2007 г. Н. Н. Какарека1, О. В. Черников2, И. В. Чикаловец2, В. И. Молчанова2, А. В. Курика2, Ю. Г. Волков1, 3. Н. Козловская1
1Биолого-почвенный институт ДВО РАН, Владивосток 2Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток
Исследовано воздействие лектинов из морских беспозвоночных на фитопатогенные вирусы с изометрическим (вирус огуречной мозаики) и нитевидным капсидом (У вирус картофеля) и на три вируса, заражающие человека (цитомегаловирус, вирус герпеса и вирус иммунодефицита человека). Показано, что лектины могут связываться с капсидом фитовирусов. Получены данные о повышении уровня толерантности вируса огуречной мозаики и растений табака при обработке лектином. Установлено, что для каждого из исследуемых вирусов человека характерна своя специфика взаимодействия с лектинами.
ВВЕДЕНИЕ
Углевод-белковое взаимодействие предшествует многим биологическим процессам на клеточном уровне. В настоящее время этому виду узнавания отводится одно из наиболее важных мест при передаче информации на уровне клетки. Информация об узнавании заключена в углеводных структурах, которые представлены на поверхности клеток в виде гликоконъюгатов (гли-копротеинов, гликолипидов и полисахаридов). Эту информацию способны воспринимать белки-агглютинины (лектины), распознающие углеводы по принципу комплементарности.
Лектины были найдены в растениях, бактериях, животных, в том числе и в морских беспозвоночных. Интерес к лектинам обусловлен их уникальными свойствами: высокой избирательностью связывания с моно- и полисахаридами, а также наличием целого ряда активностей. Лекти-ны оказались полезным инструментом при исследовании сложных гликоконъюгатов и процессов, опосредованных ими. Они используются в качестве маркеров нормальных и патологических клеток и тканей, а также при определении групп крови человека [13]. Наиболее полно изучены агглютинины из наземных растений и животных.
В последние десятилетия морские организмы интенсивно изучаются как потенциальные источники новых биологически активных соединений [8, 9]. Хотя вопрос о физиологической роли лектинов из морских беспозвоночных остается нерешенным, появляется все больше данных, свидетельствующих об участии их в таких неспецифических иммунных реакциях, как агглютинация, опсонизация и лизис [6]. Взаимодействуя с угле-
водными структурами на поверхности бактерий, лектины агглютинируют их в сгустки, которые впоследствии лизируются [4].
Поскольку в состав оболочек животных вирусов входят углеводные компоненты, то лектины могут рассматриваться и как потенциальные антивирусные соединения. Лектины взаимодействуют с рецепторами внешней поверхности некоторых вирусов, блокируя их проникновение в клетки человека и животных [11, 19]. В работе Бабоша [1] показано, что содержание и состав эндогенных лектинов изменяется в процессе формирования некрозов на листьях табака, инфицированных ВТМ. В механизмах формирования фитоиммуни-тета лектины также играют важную роль. В то же время эти механизмы практически не изучены. Нами были взяты типичные представители изометрических и нитевидных РНК-вирусов - вирус огуречной мозаики (ВОМ) и У-вирус картофеля (УВК). Они являются одними из наиболее вредоносных и поражают повсеместно картофель, перец, табак, томат, в значительной степени снижая урожайность этих культур. Изометрические частицы ВОМ содержат РНК с М > 3 мДа и белок оболочки с М = 24-25 кДа [12]. Нитевидные частицы УВК содержат одноцепочечную РНК с М = 3.1 мДа и белок оболочки с М = 33.0 кДа, состоящий из 286 аминокислотных остатков [20].
Цель работы - исследование молекулярных механизмов взаимодействия лектинов из морских беспозвоночных с растительными РНК-вирусами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали GlcNAc- и GlcNAc/ GalNAc-специфичные лектины, выделенные из
колониальной асцидии Didemnum ternatanum (DTL) и (DTL-A) соответственно, Gal/GalNAc-спе-цифичный лектин из моллюска Crenomytilus gray-anus (CGL) [7, 9.18].
Объекты исследования: шесть штаммов ВОМ и шесть штаммов YBK. Два штамма ВОМ выявлены в Приморском крае на картофеле сорта Аноста (ВОМан), кабачке (ВОМкаб) и один - на картофеле из КНР (ВОМк/кит). Три штамма любезно предоставлены корейскими коллегами из Института физиологии растений (г. Пхеньян, КНДР): из огурца (ВОМо/кор), сои (ВОМс/кор) и картофеля (ВОМк/кор) [12]. Штаммы YBK выявлены на картофеле: неустановленного сорта из КНР (УВКк/кит); сорта Пушкинец из Московской области (УВКпуш) и сорта Филатовский (УВКфил); на дикорастущих растениях из Приморского края: репяшке зубчатом (УВКреп), пионе молочноцветковом (УВКпион) и хмелевнике японском (УВКхме).
Тест-системы к вирусам герпеса, цитомегало-вирусу и антигену Р24 ВИЧ были любезно предоставлены Приморским краевым СПИД-центром.
Здоровые растения табака Nicotiana tabacum L. сорта Ксанти нк инфицировали механически ВОМ и YBK. Очищенные препараты изолятов ВОМ получали по частично модифицированной нами методике [16]. Очистку YBK проводили по модифицированной нами методике, предложенной в [3]. Концентрацию и чистоту вирусных препаратов определяли спектрофотометрически. Наличие примесей в препаратах во время очистки контролировали SDS-электрофорезом в 12% ПААГ [15].
Концентрацию вируса огуречной мозаики в растениях табака после обработки лектинами определяли непрямым методом иммунофермент-ного анализа (ИФА) [14].
Связывание лектинов с вирусами изучали твердофазным лектин-ферментным анализом (ТЛФА), используя конъюгаты лектинов (DTL, DTL-А и CGL) с пероксидазой из хрена (ЛПХ). Суспензию вирусов в концентрации 20 мкг/мл адсорбировали в течение 24 ч при 4°С на полистирольный планшет (Nunc, Дания). Для предотвращения неспецифической сорбции ЛПХ планшет обрабатывали бычьим сывороточным альбумином в концентрации 1 мг/мл 2 ч при 37°С. После промывки добавляли ЛПХ, разведенные от 1 : 50 до 1 : 3200, и оставляли еще на 2 ч при 37°С.
Связывание лектина с вирусами определяли фотометрическим методом с раствором о-фени-лендиамина и перекиси водорода на Мультискане при 492 нм, останавливая реакцию серной кислотой (4 н.). Ингибирование связывания определяли методом ТЛФА, при этом на адсорбированные вирусы титровали двойными разведениями моносахариды, используемые в качестве ингибиторов,
А (492 нм) 2.0 г
1.6
1.2
0.8 0.4 0
1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
■ CGL
□ DTL
□ DTL-A
2 3 4 5 6
■ CGL
□ DTL
□ DTL-A
9 10 11 12 Штамм
Рис. 1. Взаимодействие лектинов со штаммами ВОМ (а) и УВК (•): 1 - ВОМан, 2 - ВОМо/кор, 3 - ВОМкаб, 4 - ВОМк/кор, 5 - ВОМк/кит, 6 - ВОМс/кор, 7 -УВКпуш, 8 - УВКфил, 9 - УВКхме, 10 - УВКпион, 11 - УВКк/кит, 12 - УВКреп.
и одновременно добавляли конъюгаты ЛПХ в выбранной концентрации.
Углеводный состав вирусов определяли методами газожидкостной хроматографии (ГЖХ) и ГЖХ-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС) [17].
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В настоящей работе приведены результаты по сравнительному изучению связывания лектинов морских беспозвоночных со штаммами изометрических и нитевидных растительных вирусов: ВОМ (шесть штаммов) и УВК (шесть штаммов) методом ТЛФА. Очищенные препараты ВОМ и УВК имели характерные, как для нуклеопротеидов, УФ-спектры поглощения. Электрофорез в ПААГ капсидных белков препаратов штаммов ВОМ показал наличие в составе их вирионов одного полипептида, кроме ВОМо/кор, который в отличие от других исследуемых изолятов имеет два полипептида, что свидетельствует о смеси двух штаммов в препарате [2]. Молекулярная масса капсидных белков некротических штаммов УВК, определенная электрофорезом, составляет для всех штаммов 32-34 кДа. Кроме основного белка, наблюдали 3 минорных компонента. В препарате УВКк/кит наблюдали только один полипептид с M = 31-32 кДа.
а
Таблица 1. Концентрации моносахаридов, вызывающие 50% ингибирование связывания лектинов с растительными вирусами
Штамм CGL (ингибитор Gal, мг/мл)
1. ВОМан 0.19
2. ВОМкаб 0.08
3. ВОМо/кор 0.08
4. ВОМк/кор 0.08
5. ВОМк/кит 0.16
6. ВОМс/кор 0.26
7. УВКпуш 0.205
8. УВКфил 0.225
9. УВКхме 0.225
10. УВКпион 0.225
11. УВКк/кит 0.095
12. УВКреп 0.21
Примечание. Взаимодействие DTL (ингибитор GlcNAc) и DTL-A (ингибитор GalNAc) с вирусами не ингибировалось при концентрации ингибитора 5 мг/мл.
На диаграмме представлены результаты взаимодействия лектинов с различными штаммами ВОМ (рис. 1а) и YВК (рис. 16). Как видно из рис. 1, лектины обладают определенной степенью избирательности при связывании с различными вирусами. СвЬ и БТЬ-А связываются практически со всеми штаммами изометрических (ВОМ) и нитевидных ^ВК) вирусов с незначительными различиями. Но СвЬ предпочтительно реагирует со всеми штаммами ВОМ, а БТЬ-А со штаммами YВК. По интенсивности реакция БТЪ
со всеми вирусами растений выражена в меньшей степени.
Характер взаимодействия лектинов с фитови-русами определяли конкурентным методом ТЛФА. В качестве ингибиторов связывания использовали моносахариды, специфичные для каждого лекти-на: для CGL - Gal, для DTL - GkNAc, для DTL-A -GalNAc. Процент ингибирования I рассчитывали по формуле:
I = A/A0 х 100%,
где A и A0 - оптическая плотность в присутствии и в отсутствие ингибитора соответственно.
Как видно из табл. 1, ингибирование связывания лектина с вирусами наблюдается только для CGL. Взаимодействие DTL и DTL-А с вирусами не ингибировалось специфичными для них моносахаридами, природа связывания этих лектинов с вирусными частицами не ясна. Для выяснения характера связывания CGL с вирусами методами ГЖХ и ГЖХ-МС был определен углеводный состав как ВОМ, так и YBK. Известно, что углеводы в составе вирионов фитовирусов выявлены не только у представителей нескольких родов со сложным капсидом (фиторабдо-, тоспо-, фиджи-вирусы и, возможно, тенуивирусы) [10], но и у Х-вируса картофеля [21]. В результате как в ВОМ, так и в УВК были обнаружены в небольших количествах моносахариды: рибоза, манно-за, глюкоза и галактоза, которые, возможно, являю
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.