БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2012, том 29, № 5, с. 329-339
УДК 577.114.7:577.352.2.:615.277.3.
ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИПОСОМ, СОДЕРЖАЩИХ В ЛИПИДНОМ БИСЛОЕ ЛИПОФИЛЬНОЕ ПРОИЗВОДНОЕ ДОКСОРУБИЦИНА, С ОПУХОЛЕВЫМИ КЛЕТКАМИ
© 2012 г. Н. Р. Кузнецова, Е. В. Свирщевская, И. В. Скрипник, Е. Н. Зарудная, А. Н. Бенке, Г. П. Гаенко, Ю. Г. Молотковский, Е. Л. Водовозова*
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; *электронная почта: elvod@ibch.ru Поступила в редакцию 20.02.2012 г.
Применение наноразмерных липосом в качестве носителей позволяет осуществить целевую доставку противоопухолевых средств и значительно уменьшить их системную токсичность. Однако замедленная внутриклеточная разгрузка липосомных препаратов приводит к снижению эффективности проводимой терапии. Одним из способов решения этой проблемы может быть применение липофильных пролекарств, включенных в липидный бислой липосом. С целью изучения механизма взаимодействия таких препаратов с опухолевыми клетками нами получены препараты липосом из яичного фос-фатидилхолина и фосфатидилинозита дрожжей, содержащие противоопухолевый антибиотик доксо-рубицин (DOX) виде диглицеридного производного (липофильного пролекарства, DOX-DG) в мембране. Получены также липосомы из липидов, образующих высокоплавкий липидный бислой, — из дипальмитоилфосфатидилхолина и холестерина, в том числе пегилированные (несущие полиэтилен-гликольные (PEG) цепи, экспонированные в водную фазу), содержащие DOX во внутреннем водном объеме. Эффективность связывания свободного и липосомного доксорубицина с опухолевыми клетками определяли in vitro, применяя спектрофлуориметрию клеточных экстрактов, а также проточную цитометрию. Внутриклеточный трафик препаратов оценивали с помощью конфокальной микроскопии по степени колокализации их с трекерами внутриклеточных органелл. Показано, что липосомы всех типов удерживают DOX в органеллах, что замедляет его попадание в ядро. Внутриклеточное распределение липосомного DOX зависит от структуры липосом и пегилирования. Сделан вывод, что наиболее вероятным механизмом проникновения в клетку липофильного пролекарства является эн-досомный путь в составе липосом.
Ключевые слова: липосомная доставка, доксорубицин, липидные пролекарства, клеточные органел-лы, внутриклеточный трафик.
В последние годы интенсивно изучается возможность применения липосом для доставки противоопухолевых средств к злокачественным клеткам и тканям [1]. Снижение токсического действия лекарственных средств, заключенных в липосомы, на организм в целом обусловлено, в первую очередь, уменьшением их концентрации в кровотоке. Известно также, что липосомы среднего диаметра (100—150 нм) способны накапливаться в опухолях и очагах воспаления за счет повышенной проницаемости эндотелия формирующейся de novo сосудистой системы и нарушенного лимфатического дренажа в опухолевой ткани (эффект EPR, enhanced permeability and retention) [2]. Липосомы в качестве носителей уже применяются в клинике для системного введения лекарств: препараты Doxil®, Caelyx® и др. [3]. Привитые на поверхность липосом высокогидратируемые остатки полиэтиленгликоля (ПЭГ) защищают их от
преждевременного вывода из кровотока клетками ретикулоэндотелиальной системы; "пегилиро-ванные" липосомы получили название Stealth® [4].
Названные препараты представляют собой Stealth-липосомы диаметром около 100 нм, нагруженные доксорубицином. Липидный бислой построен из насыщенных фосфолипидов и холестерина и имеет высокую температуру фазового перехода, что позволяет избежать преждевременной утечки противоопухолевого агента во время циркуляции в кровотоке. При получении этих препаратов используется метод активной загрузки (remote loading) — диффузия лекарства во внутренний объем пегилированных липосом против градиентов концентраций ацетата кальция или сульфата аммония [5]. Внутри липосом лекарство, как правило, находится преимущественно в кристаллической фазе. Такой прием позволяет
Рис. 1. Структуры доксорубицина (DOX), липофильного пролекарства (DOX-DG) и схематическое изображение ли-посомных препаратов L-DOX-DG, L-DOX и L-PEG-DOX.
добиваться высокой емкости наноразмерного носителя (мольное отношение лекарство/липиды достигает 0.2—0.25). Однако метод активной загрузки реализуем только для ограниченного числа лекарств, имеющих структуру амфифильных слабых кислот или оснований, например антибиотиков антрациклинового ряда типа доксорубицина. Более того, интернализация липосом ЭохЛ® клетками значительно затруднена, и внутриклеточное высвобождение лекарства происходит очень медленно [6].
Особенности строения липосом позволяют нагружать их липофильными или амфифильны-ми молекулами, используя липидный бислой. Возможность доставки цитотоксических препаратов в опухолевые клетки в виде липофильных биодеградируемых производных (липофильных пролекарств) дает ряд преимуществ: уменьшаются потери лекарства в кровотоке и при взаимодействии липосомы с клеткой; липидные производные способны к прямому трансмембранному переносу, который может кардинально изменить механизм эндоцитоза и внутриклеточного транспорта препарата и облегчить разгрузку липосом. Кроме того, включение пролекарств в мембрану липосом упрощает и делает универсальной технологию их приготовления. После вхождения в клетку липофильный остаток отщепляется внут-
риклеточными ферментами, высвобождая активный агент. Ранее мы показали, что липофильные пролекарства некоторых широко применяемых в клинике противоопухолевых препаратов, полученные в виде диглицеридных сложноэфирных производных, хорошо встраиваются в липидный бислой 100-нм липосом, сформированных на основе природных фосфолипидов (мольное отношение пролекарство/липиды около 0.1) [7] и в липосомных формах устойчивы к преждевременному гидролизу эстеразами плазмы крови человека [8]. Противоопухолевое действие липофиль-ных пролекарств в составе липосом показано in vivo на моделях лимфолейкоза и рака молочной железы мышей [9—11].
В то же время механизм взаимодействия с опухолевыми клетками липосом, несущих в бислое липидные производные лекарств, пока не выяснен. Доксорубицин представляется удобным объектом для изучения этого процесса с помощью флуоресцентных методов, так как он обладает собственной флуоресценцией в красной области спектра (^возбАисп 495/595 нм). Молекула доксо-рубицина (DOX) состоит из тетрациклического антрахиноидного агликона доксорубицинона, соединенного гликозидной связью с аминосаха-ром даунозамином (рис. 1). Модификация по остатку даунозамина не должна отражаться на оп-
тических свойствах тетрациклического флуорофо-ра. Нами синтезирован диглицеридный конъюгат доксорубицина (DOX-DG, рис. 1). Цель настоящей работы — исследование флуоресцентными методами механизма эндоцитоза и внутриклеточного транспорта (трафика) липосом, несущих в бислое диглицеридный конъюгат доксорубици-на, в сравнении с самим доксорубицином и пеги-лированными липосомами (типа Stealth), содержащими доксорубицин в водной фазе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы. Использовали перегнанные растворители и реагенты отечественного производства, фосфатидилхолин (еРС) из яичного желтка и фосфатидилинозит (PI) из Saccharomyces cerevisiae производства Реахим (Россия), доксорубицин (Teva, Израиль), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), холестерин (Chol) и ПЭГ(2000)-диолео-илфосфатидилэтаноламин (PEG-PE) производства Avanti Polar Lipids (США), сефадекс G-75 и сефарозу CL-4B (Pharmacia, Швеция). Синтез гас-1,2-диолеоил-3-[доксорубиции-^сукцинил-№-(3-аминопропионил)] глицерина (DOX-DG) будет описан в другой статье.
Липосомы. Липосомы готовили на PBS — физиологическом растворе на фосфатном буфере (KH2PO4, 0.2 г/л; NaH2PO4 • 2H2O, 0.15 г/л; Na2HPO4, 1.0 г/л; KCl, 0.2 г/л; NaCl, 8.0 г/л), содержащем 1 мМ EDTA, pH 7.06.
Липидные пленки получали упариванием смесей липидов из растворов в смеси хлороформ-метанол, 2 : 1, в круглодонных пробирках на роторном испарителе с последующим высушиванием в течение 1 ч при 5 Па. Для получения липосом, нагруженных доксорубицином во внутреннем объеме, готовили пленки из смесей DPPC-Chol, 7 : 3, или DPPC-Chol-PEG-PE, 6.8 : 3 : 0.2 (мол.). Смеси содержали по 7.05 мг DPPC и 1.59 мг Chol или 6.85 мг DPPC, 1.59 мг Chol и 0.77 мг PEG-PE. Ли-пидные пленки гидратировали в 350 мкл PBS, рН 6.5, при 60-70°С в течение 2 ч, затем прибавляли 28 мкл базового раствора DOX (10 мг/мл = = 17.24 мМ) и еще 30 мкл PBS, рН 6.5. Суспензии подвергали 7-кратной процедуре замораживания-оттаивания (жидкий азот —ь60-70°С), обрабатывали в течение 5 мин на ультразвуковой бане (UM-1, Польша) и продавливали 10 раз через поликарбонатные мембранные фильтры с размером пор 200 нм (Nucleopore, США) с помощью ручного прибора Mini-extruder (Avanti, США) предварительно нагретого до 60-70°С. Последующую экструзию в тех же условиях через фильтры с порами 100 нм удалось провести только для образцов липосом без PEG-PE (L-DOX), так как
дисперсии липосом с PEG-PE (L-PEG-DOX) не проходили через мембраны при продавливании, а лишь уменьшались в объеме при сжатии, оказывая сильное сопротивление. Далее отделяли липосомы от невключившегося DOX гель-фильтрацией на сефадексе G-75 (колонка 16 мл), выделяя дисперсии (примерно по 0.6 мл) сразу после выхода свободного объема.
Липосомы, нагруженные DOX-DG (L-DOX-DG), получали как описано ранее для других ли-пофильных пролекарств [7, 8]. Готовили пленку из смеси ePC-PI-DOX-DG, 8 : 1 : 1 (мол.), упаривая при температуре не выше 40°С. Сухая пленка содержала 0.2 мг PC, 0.028 мг PI и 0.043 мг DOX-DG (33 нмоль), ее гидратировали в течение 2 ч при комнатной температуре в 0.8 мл PBS. Суспензию встряхивали, подвергали 5-кратной процедуре замораживания-оттаивания (жидкий азот -+40°С) и продавливали 20 раз через фильтры с порами размером 100 нм (см. выше). Включение DOX-DG в липосомы контролировали при помощи гель-хроматографии на колонке с сефарозой, анализируя фракции спектрофлуориметрически по калибровочному графику для растворов DOX в подкисленном этаноле (см. далее). Колонку
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.