научная статья по теме ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ РЕГУЛИРУЮЩИМ АДГЕЗИЮ/РОСТ ГАЛЕКТИНОМ-1 ЧЕЛОВЕКА И ЛИПИДНЫМ МОНОСЛОЕМ DPPE : GM1 НА ГРАНИЦЕ ФАЗ ВОЗДУХ/ВОДА С ПОМОЩЬЮ РЕНТГЕНОВСКОГО ОТРАЖЕНИЯ И ДИФРАКЦИИ ПОД СКОЛЬЗЯЩИМИ УГЛАМИ Химия

Текст научной статьи на тему «ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ РЕГУЛИРУЮЩИМ АДГЕЗИЮ/РОСТ ГАЛЕКТИНОМ-1 ЧЕЛОВЕКА И ЛИПИДНЫМ МОНОСЛОЕМ DPPE : GM1 НА ГРАНИЦЕ ФАЗ ВОЗДУХ/ВОДА С ПОМОЩЬЮ РЕНТГЕНОВСКОГО ОТРАЖЕНИЯ И ДИФРАКЦИИ ПОД СКОЛЬЗЯЩИМИ УГЛАМИ»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 7, с. 1119 - 1134

УДК 577.124

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ РЕГУЛИРУЮЩИМ АДГЕЗИЮ/РОСТ ГАЛЕКТИНОМ-1 ЧЕЛОВЕКА И ЛИПИДНЫМ МОНОСЛОЕМ DPPE : GM1 НА ГРАНИЦЕ ФАЗ ВОЗДУХ/ВОДА С ПОМОЩЬЮ РЕНТГЕНОВСКОГО ОТРАЖЕНИЯ И ДИФРАКЦИИ ПОД СКОЛЬЗЯЩИМИ УГЛАМИ

© 2015 Я. Мажевски1, С. Андрэ2, Э. Джонс3, Э. Чи3, Х.-Ж. Габиус2*

1 Центр нейтронного рассеивания им. Мануэля Лихуан (мл.), Лос-Аламосский центр по изучению физики нейтронов, Лос-Аламосская национальная лаборатория, Лос Аламос, Нью-Мексико, США

2 Университет Людвига-Максимилиана, Институт физиологической химии,

факультет ветеринарной медицины, Мюнхен, Ветеринарштрассе, 13, 80539, Германия; электронная почта: gabius@tiph.vetmed.uni-muenchen.de,

gabius@lectins.de

3 Университет Нью-Мексико, Отдел химической и биологической инженерии,

Центр биомедицинской инженерии, Альбукерке, Нью-Мексико, США

Поступила в редакцию 26.10.14 После доработки 14.04.15

Специфическое взаимодействие ганглиозида вМ1 с гомодимерным галектином-1 (лектин прото-типа) инициирует регуляцию роста в опухолях и активированных эффекторных Т-клетках. Эта доказанная биорелевантность привела к росту интереса к изучению ассоциации лектинов (в биоэффективной концентрации) с модельной поверхностью, а именно монослоем, построенным из ^-дигексадеканоил^-глицеро-З-фосфоэтаноламина и ганглиозида вМ1 (80 : 20 мол. %). При достижении давления 20 мН/м было зафиксировано поверхностное расширение, вызванное встраиванием лектина. Временное снижение доли упорядоченной фазы липида в монослое было выявлено с помощью сочетания методов дифракции под скользящими углами и рентгеновского отражения. Экспериментальные значения распределения электронной плотности указывают на то, что галектин-1 ориентирован своей длинной осью вдоль поверхности, что идеально подходит для цис-сшивки. Полученные данные выявили принципиальное отличие от того, как связывается с тем же монослоем другой вМ1-специфический лектин — пентамер холерного токсина. Полученные данные говорят о необходимости изучения в тех же экспериментальных условиях других членов семейства га-лектинов, в частности галектина-3 «химерного» типа, который является биологическим антагонистом га-лектина-1.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: агглютинин, пики Брэгга, ганглиозид, лектин, рентгеновская дифракция/отражение.

Ганглиозиды, компоненты клеточных микродоменов, привлекают все больше внимания благодаря их многочисленным функциям, в частности в качестве партнеров лектинов, таких как пентамер холерного токсина (Ох) [1—4]. Недавно было установлено, что ганглиозид ОМ1, противорецептор Ох, является физиологической мишенью для регулирующих адгезию

Принятые сокращения: Ctx — пентамер холерного токсина, Gal — галектин, DPPE — 1,2-дигексадеканоил-.УЯ-глицеро-3-фосфоэтаноламин, GIXD — рентгеновская дифракция под скользящими углами, XR — рентгеновское отражение, LC-фаза — липидная конденсированная фаза, PSD — позиционно-чувствительный детектор.

* Адресат для корреспонденции.

и рост галектинов человека — семейства белков, для которых характерны в-сэндвич-складка и сигнатурная последовательность с центральным остатком триптофана, контактирующего с ли-гандом [5—8]. Пентасахарид ОМ1 имеет разветвленную структуру (рис. 1, б). Галектины связывают обе ветви, причем не тот конформер глика-на, который взаимодействует с Ох [9, 10]. Для количественной оценки стабильности комплексов с гликанами использовалась атомно-сило-вая микроскопия. Кинетика диссоциации под влиянием комплексов прото-типа (гомодимер-ного) галектина-1 (Оа1-1) и типичных лигандов (лактоза, асиалофетуин) согласуется с транзиент-ным транс-мостиковым взаимодействием и

цис-сшивкой [11]. Функционально Gal-1 осуществляет контроль роста через связывание GM1 на клетках нейробластомы человека (SK-N-MC) и активированных эффекторных T-клет-ках in vitro [12—16]. В обоих случаях GM1 становится доступным в результате ферментативного действия сиалидазы на его предшественника GD1a. На примере бактериальных AB5 токсинов и их проникновения в клетки [17, 18] было показано, что связывание с ганглиозидом также участвует в быстрой интернализации Gal-1, наб-

Рис. 1. Структуры (глико)сфинголипидов DPPE (а) и GM1 (б), компонентов липидной пленки

людаемой в Т-лейкозных клетках Jurkat [19]. Любопытно, что бактериальные лектины, специфичные к пентамерному GM1, по всей видимости, также способны облегчать течение аутоиммунных расстройств у модельных животных [20—22]. Однако способность мембраны реагировать на Ctx и лектины человека не обязательно опосредована таким же механизмом постсвязывания: регуляторами роста для клеток ней-робластомы являются только лектины человека

[23]. Это функциональное различие позволяет предположить различия и в топологических свойствах комплекса, что навело нас на мысль о необходимости изучения связывания галекти-нов в биоэффективной концентрации с GM1-содержащими модельными поверхностями.

Помимо влияния на пролиферацию, а также клеточное поглощение и маршрутизацию изучение связи Gal-1 с поверхностью трипсинизиро-ванных эритроцитов выявило изменения в текучести мембран и их осмотической устойчивости

[24]. Этот эффект может зависеть от изменений в четвертичной структуре Gal-1 при попадании в гидрофобную среду. Показано, что в апротон-ных растворителях (например, диметилсуль-фоксиде) лектин образует димеры из двух гомо-димеров цилиндрической формы [25]. В совокупности эти доказательства навели нас на мысль начать наше исследование с изучения возможности встраивания этого сильного эффектора в липидный монослой.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы. 1,2-Дигексадеканоил-^п-глице-ро-3-фосфоэтаноламин (DPPE) и ганглиозид GM1 (из овечьего мозга, аммонийная соль, порошок) были куплены у компании «Avanti Polar Lipids» (США) и использованы без дальнейшей очистки (структуры приведены на рис. 1). Стоковые растворы каждого из (глико)сфинголи-пидов (~5 мг/мл) были сначала приготовлены в хлороформе, содержавшем 9% об. метанола и 1% об. воды. Затем был приготовлен раствор для образования липидного монослоя (0,3 мг/мл), содержавший 80% мол. DPPE и 20% мол. GM1 (8 : 2 DPPE : GM1), который до использования хранили при —20° в стеклянных пробирках. Ре-комбинантный Gal-1 человека был очищен аффинной хроматографией (ключевая стадия), и его чистота и биологическая активность контролировались с помощью двумерного гель-электрофореза, масс-спектрометрии, гемагглютина-ции и тестов на замедление роста [12, 26—28].

Тест встраивания в липидный монослой при постоянном давлении. Эксперименты по опреде-

лению встраивания белка в монослой на границе фаз воздух/буфер при постоянном поверхностном давлении проводили в ленгмюровской ванне станции BW1 (ондулятор) в пучке синхро-тронного излучения из синхротрона «HASYLAB» (Германия), как описано ранее [29]. Схема экспериментальной установки для измерения встраивания белка при постоянном давлении и ход эксперимента приведены на рис. 2. Термо-статируемая ванна при специальном дифракто-метре для жидких поверхностей была оборудована пластиной Вильгельми, которая измеряет поверхностное давление на границе воздух/буфер, и подвижной гидрофобной тефлоновой загородкой, которая контролирует площадь поверхности ванны. Перед началом эксперимента ванну заполняли ~240 мл субфазового буфера (20 нМ фосфатно-солевого буфера (PBS), pH 7,2, содержавшего 6,2 мМ Na2HPO4, 4 мМ KH2PO4, 154 мМ NaCl и 1% NaN3) при 20°. Затем по границе воздух/буфер распределяли раствор смеси липидов (8 : 2 DPPE : GM1, 90 : 9 : 1 хлороформ : : метанол : вода). Систему оставляли уравновешиваться на 15 мин для обеспечения полного упаривания органического растворителя, после чего липидный монослой сжимали до поверхностного давления 20 мН/м и с помощью петли обратной связи удерживали данное давление на постоянном уровне на протяжении оставшейся части эксперимента (рис. 2, а). Затем были получены данные рентгеновского рассеяния для липидной пленки при 20 мН/м и 20° (подробное описание эксперимента приведено ниже). Определив таким образом контрольное значение, проводили эксперименты в присутствии Gal-1. Аликвоту раствора, содержавшего Gal-1 (5 мг, PBS), инжектировали в субфазовый буфер в ванне и оставляли уравновешиваться с липид-ным монослоем (рис. 2, б). Концентрация галек-тина в субфазе в ванной составляла ~21 мкг/мл. Поскольку поверхностное давление липидного монослоя удерживалось на одном уровне, встраивание Gal-1 в липидный монослой должно приводить к расширению площади поверхности (рис. 2, в). Таким образом, измеримое расширение поверхности монослоя считается показателем продуктивного взаимодействия галектин— мембрана. Данные рентгеновского рассеяния были получены через 5 и 13 (t2) ч после введения Gal-1-содержащего раствора.

Измерения рентгеновского рассеяния. Для установления структуры пленки липидного монослоя, содержавшего Gal-1, на молекулярном уровне были дополнительно получены данные рентгеновской дифракции под скользящими углами (GIXD) и рентгеновского отражения (XR) до (только липидная мембрана) и в два момента

времени после (t1 и t2) добавления раствора Gal-1 под липидный монослой. Рентгеновский пучок, направленный на образец, имел длину волны X =1,30 ± 0,02 Á (9510 эВ) и мощность ~0,3 мВт. Для уменьшения фонового рассеяния и минимизации окисления белок-липидной пленки рентгеновским пучком ванну-контейнер предварительно продували гелием в течение 30—40 мин.

а

Surface Pressure

PBS

21 ng/mL Gal-1

в

Рис. 2. а — Компрессия липидного монослоя до 20 мН/м. Для измерения поверхностного давления липидного монослоя использовалась пластина Вильгельми (я), которая связана с поверхностным натяжением пленки (у) на границе воздух/вода; б — введение Gal-1 в субфазу. Белок вводили в субфазу под барьер, используя L-образную иглу шприца для минимизации нарушения липидного монослоя. Выбранная концентрация Gal-1 известна как биоэффективная в in vitro тестах GM1-зависимого роста клеток; в — расширение липидного монослоя в результате встраивания Gal-1. Гомодимерный лектин и его два сайта связывания изображены в масштабе и реальной форме, исходя из пр

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком