БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Том 19 * № 2 * 1993
УДК 547.814 : 577.161
© 1993 г. В. В. Чудинова, Е. И. Захарова, С. М. Алексеев, В. В. Чупиы, Р. П. Евстигнеева
ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ а-ТОКОФЕРОЛА С ФОСФОЛИПИДАМИ, ЖИРНЫМИ КИСЛОТАМИ И ИХ ОКСИГЕНИРОВАННЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ МЕТОДОМ 3,Р-ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ
Московский, институт тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова
Методом 3|Р-ЯМР-спектроскопии на моделях искусственных мембран, содержащих яичный фос-фатидилхолин и лизофссфатидилхолин, исследовано взаимодействие а-токоферола с фосфолипидами, олеиновой, рицинолевой кислотами и гидропероксидом линолевой кислоты. Показано, что а-токоферол поддерживает бислойную организацию водных дисперсий лизофосфолипидов, а при включении в систему лецитин — вода способствует образованию гексагональной фазы. Свободные жирные кислоты проявляли синергизм а-токоферолу, причем в наибольшей степени эффект образования гексагональной фазы усиливали оксигенированные кислоты — рицинолевая и гидропероксид линолевой кислоты. На основании экспериментальных данных сделаны выводы о структурообразующем и модифицирующем действии «-токоферола. Обсуждена природа модулирующего эффекта а-токоферола на структуру мембраны и возможная роль образующейся под его действием гексагональной фазы в процессе перекисногс окисления липидов.
а-Токоферол (витамин Е) — жирорастворимый антиоксидант, локализованный непосредственно в гидрофобной части биологических мембран [1 ]. Известно, что основной функцией витамина Е является защита полиненасыщенных ацильных остатков фосфолипидов от перекисного окисления [2 ]. Кроме того, а-токоферол обладает мембраноструктурирующим действием, модифицируя физические свойства липидного бислоя [3—5]. Считается, что он участвует в специфическом гидрофобном взаимодействии с ацильными цепями компонентов мембран, а также со свободными жирными кислотами, нивелируя их хаотропное действие и предотвращая отрицательное воздействие фосфолипазы А2 [6—8]. В связи с этим особое значение приобретают исследования влияния а-токоферола на структурную организацию липидов в мембране.
Целью нашей работы явилось исследование взаимодействия а-токоферола с фосфолипидами, жирными кислотами и продуктами их первичного окисления на моделях искусственных мембран, содержащих яичный лецитин и лизолецитин. В качестве метода была выбрана Р-ЯМР-спектроскопия, позволяющая определить структуру агрегатов в дисперсии липидов [9 ].
Известно, что лизофосфолипиды — продукты ферментативного гидролиза компонентов мембраны — обладают дестабилизирующим действием на бислойные структуры и оказывают отрицательное влияние на функционирование биологических мембран [10].
В связи с этим нами были изучены модельные мембранные структуры, образующиеся из лизолецитина в присутствии 20 и 100% * воды, методом Р-ЯМР-спектроскопии с широкополосной развязкой от протонов.
* Здесь и далее, где не указано особо, приведены проценты по массе.
4*
243
1 I I I 1 . I I г I I I_I I 1_I_1—1
40 20 О -20 -40 40 20 0 -20 -40 м.д.
Рис. 1.3|Р-ЯМР-спектры лизофосфатидилхолина в 20 (а) и 100% водной суспензии
(б), а также эквимолярной смеси лизофосфатидилхолина и а-токоферола в 20
(в) и 100% водной суспензии (г)
50 0 - 50 м.д.
Рис. 2. 3,Р-ЯМР-спектры яичного фосфатидилхолина (а), смеси фосфатидилхолина с а-токоферолом (10 мол. %) в 100%, водной суспензии (б) и при избытке
воды (а)
Из представленных на рис. 1 спектров видно, что исходный сигнал лизолецитина (рис. 1 а) в 20% водной суспензии имеет отчетливо выраженную анизотропию, аналогичную спектру лецитина (рис. 2а), что характерно для сформировавшегося бислоя. Однако при добавлении воды до 100% сформированная лизолецитином бислойная структура полностью разрушалась, превращаясь в мицеллярную с характерным изотропным сигналом (рис. 16).
При исследовании образцов лизолецитина, содержащих эквимолярное количество а-токоферола, в спектре наблюдалось по крайней мере два отчетливо выраженных анизотропных сигнала, соответствующих различным бислойным структурам, которые сохранялись и при добавлении воды (рис. 1в, г).
В аналогичных опытах с хроманами С19 и С1 было показано, что бислойные структуры практически не образуются. В случае хромана С19 наблюдалась лишь небольшая асимметрия сигнала без характерного изменения формы, а в присутствии хромана С1 происходило только уширение сигнала.
(¿-тоноцзероп К=
хроман С, К=СН3
СН3 хроман (Цд В.=
Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что а-токоферол в отличие от своих структурных аналогов с модифицированной боковой цепью — хромана С1 (отсутствует боковая цепь) и хромана С19 (неразветвленная боковая цепь), встраиваясь между молекулами лизофосфати-дилхолина, способствует их упаковке в бислой, т. е. обладает ярко выраженной мембраноструктурирующей активностью. Это можно объяснить комплементар-ностью молекул а-токоферола и лизолецитина. Способность липидов образовывать различные фазы зависит от их динамической структуры. Известно, что для лизолецитина объем, занимаемый полярной областью, больше, чем гидрофобной, что обусловливает его форму усеченного конуса, в основании которого расположена гидрофильная часть молекулы [11]. Структурообразующие свойства а-токоферола, в частности способность стабилизировать бислойную структуру лизофосфолипидов, можно, по-видимому, объяснить тем, что для молекулы а-токоферола характерны обратное соотношение объемов полярной и гидрофобной частей и форма усеченного конуса, вершиной которого служит гидроксильная группа хроманового ядра.
Такая форма молекулы а-токоферола должна при введении его в фосфати-дилхолиновые слои способствовать образованию гексагональной фазы, что было подтверждено в ряде работ [12, 13]. Такая небислойная организация фосфолипидов играет важную роль в функционировании мембраны, в частности в процессах транспорта полярных соединений (флип-флопа) может служить переходным состоянием при слиянии везикул [12]. Кроме того, наличие гексагональной фазы коррелирует с активностью некоторых ферментов, например протеинкиназы С [14].
В связи с этим нами было изучено взаимодействие яичного лецитина с а-токоферолом в 100% водной суспензии и липосомальной системе при избытке воды. Анализ " Р-ЯМР-спектров изученных образцов при избытке воды (рис. 3) показал, что включение возрастающих количеств а-гокоферола (от 10 до 50 мол. %) в бислой лецитина приводит к изменению его организации и появлению новых липидных структур.
Введение в 100% водную суспензию лецитина 10 мол. % а-токоферола уже вызывало изменение вида спектра, которое можно интерпретировать как наличие в липидной системе двух различных бислойных фаз (рис. 26). Новая бислойная фаза характеризовалась наличием асимметричного сигнала с плечом, направленным в сторону слабого поля, но значительно меньшей анизотропией химического сдвига по сравнению с обычными фосфатидилхолиновыми бислоями. Образование новой бислойной фазы еще более ярко было выражено в присутствии 20 мол. % а-токоферола. Однако при добавлении избытка воды спектры проанализированных смесей приобретали вид, идентичный спектру системы лецитин — вода (см. рис. 2в). Можно предположить, что образование модифицированной бислойной структуры связано с количеством структурированной воды, влияющей на динамику мембранной системы.
I ' . I ' I I I I I ■ I . I I - ■) 80 40 0 -40 М.Д.
I I . 1 . I I I I I I I I I I 1
ДО 40 0 - 40 м. д.
Рис. 4
Рис. 3
Рис. 3. 31Р-ЯМР-спектры смеси яичного фосфатидилхолина с «-токоферолом при избытке воды. Количество а-токоферола (мол. %): 0 (а), 10 (б), 20 (в), 40 (г), 50 (д)
Рис. 4. 31Р-ЯМР~спектры смеси яичного фосфатидилхолина с «-токоферолом и жирными кислотами при избытке воды: а — фосфатидилхолин — «-токоферол — олеиновая кислота; б — фосфатидилхо-лин — «-токоферол — рицинолевая кислота; в — фосфатидилхолин — а-токоферол — гидропероксид линолевой кислоты. Содержание «-токоферола — 40 мол. %, жирных кислот— 10 мол. %
31
При увеличении количества а-токоферола до 40 мол. % в Р-ЯМР-спектре лецитина появлялся сигнал с пиком 7 м. д., с обращенной асимметрией и меньшей шириной, характерный для образования гексагональной фазы (рис. Зг), а также изотропный сигнал, который, по-видимому, соответствует инвертированной мицеллярной и фрагментам укороченных гексагональных структур [11]. Интенсивность этих сигналов возрастала с увеличением количества а-токоферола, и при содержании последнего в исследуемой смеси 50 мол. % соотношение основной бислойной и небислойной фаз составляло приблизительно 1 : 1 (рис. 35), что хорошо согласуется с литературными данными [12]. Таким образом, полученные нами экспериментальные результаты свидетельствуют о том, что а-токоферол в высоких концентрациях модифицирует мембранную структуру, способствуя переходу ламеллярной фазы через переходную бислойную в гексагональную.
Эти данные могут иметь важное значение для понимания механизма функционирования биологических мембран, поскольку молекулы а-токоферола, тяготея к наименее вязким доменам липидных структур, способны образовывать кластеры [15, 16] с высокой локальной концентрацией.
С другой стороны, витамин Е — наиболее эффективный природный антиок-сидант, ингибирующий развитие цепной реакции перекисного окисления липидов, продукты которого обладают дестабилизирующим действием на мембранные структуры [17]. Ранее нами было показано, что а-токоферол способен образовывать комплексы с высокоэнергетическими продуктами такого окисления [18] в гомо-
генных растворах, причем образование таких возбужденных ассоциатов может быть ключевым моментом его антиоксидантного действия. Известно также, что а-токоферол предотвращает хаотропное воздействие свободных жирных кислот на мембрану [6—9]. Поэтому мы исследовали взаимодействие а-токоферола со свободными жирными кислотами и их оксигенированными производными в составе липидных суспензий— 100% и при избытке воды — методом Р-ЯМР-спектро-скопии. В качестве моделей нами были выбраны олеиновая кислота, ее гидро-ксилсодержащее производное — ридинолевая кислота — и гидропероксид лино-левой кис
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.