МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 343-349
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.282.123.2.017.61.7:577.152.1
ИЗУЧЕНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ РОСТА И ОБРАЗОВАНИЯ ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ У МУТАНТНЫХ ШТАММОВ PENICILLIUM FUNICULOSUM
© 2004 г. Т. В. Семашко, Р. В. Михайлова, А. Г. Лобанок
Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь, 220141 Поступила в редакцию 11.02.03 г.
Изучены основные закономерности роста мутантных штаммов Pénicillium funiculosum БИМ F-15.3, HMM95.132, 46.1 и биосинтеза ими глюкозооксидазы. Отмечен конститутивный характер образования фермента грибами. Показано, что синтез внеклеточной глюкозооксидазы происходит в постэкспоненциальной фазе развития культур. Фазы роста грибов и образования фермента разобщены во времени. Штаммы P. funiculosum продуцируют также внеклеточную инвертазу и клеточнос-вязанные каталазу и глюкозооксидазу. Максимальный уровень синтеза инвертазы достигался к 14-18 ч ферментации, клеточносязанных ферментов - к 48-52 ч, а внеклеточной глюкозооксидазы - к 96 ч. Установлено, что из исследуемых культур P. funiculosum 46.1 характеризовался максимальными скоростями роста и синтеза глюкозооксидазы.
Ключевые слова: Pénicillium funiculosum, мутантные штаммы, биосинтез фермента, глюкозооксидаза.
Глюкозооксидаза ф-0-глюкозо:1-02 оксидо-редуктаза, КФ 1.1.3.4), фермент класса оксидоре-дуктаз, который катализирует реакцию окисления ß-D-глюкозы до ß-D-глюконо-ô-лактона и перекиси водорода. Фермент используется в пищевой, химической промышленности, медицине и научных исследованиях [1]. Основными его продуцентами являются мицелиальные грибы родов Aspergillus и Pénicillium. В литературе представлены данные по продукции глюкозооксидазы грибами и свойствам глюкозоокисляющего фермента [1]. Следует отметить, что закономерности роста продуцентов и биосинтез глюкозооксидазы, а также регуляторные механизмы образования фермента в настоящее время практически не изучены.
Ранее нами исследованы спонтанная и индуцированная изменчивость продуцента внеклеточной глюкозооксидазы Pénicillium funiculosum БИМ F-15. Получены мутантные штаммы: P. funiculosum БИМ F-15.3, P. funiculosum HMM95.132 и P. funiculosum 46.1 [2-4].
Цель настоящей работы - изучение закономерностей роста мутантов P. funiculosum и образования глюкозооксидазы исследуемыми грибами.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объектов исследования использовали мутантные штаммы: Pénicillium funiculosum БИМ F-15.3 [3], P. funiculosum HMM95.132 [2] и P. funiculosum 46.1 [4]. Для хранения грибов применяли агаризованную среду Чапека.
Динамику роста грибных колоний изучали при выращивании культур на агаризованной среде Чапека в течение 7 сут. Радиальную скорость роста грибов рассчитывали по формуле: Кг = — , где
йг
ёг - изменение радиуса колонии в течение времени бх [5].
Культивирование грибов осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл среды на качалке (180-200 об/мин) при температуре 24-28°С в течение 96 ч. В опытах использовали питательную среду, содержащую (%): КК03 - 0.8, КН2Р04 -0.1, М§Б04 ■ 7Н20 - 0.05, КС1 - 0.05, РеБ04 ■ 7Н20 -0.00005, Ми804 ■ 5Н20 - 0.00026, экстракт солодовых ростков - 1.0, сахарозу - 6.0. Исходный рН питательной среды 5.0.
Посевным материалом служила водная суспензия спор (4-6 х 104 спор/мл), полученных после выращивания грибов в течение 7 сут на агаризованной среде Чапека при 24-26°С.
По окончании культивирования биомассу грибов отделяли фильтрованием, промывали, высушивали при 105°С до постоянного веса и ее количество определяли весовым методом.
Активность ферментов в зависимости от целей эксперимента определяли в фильтратах куль-туральной жидкости, а также в бесклеточных го-могенатах. Для получения последних отмытый мицелий грибов (1 г по сырому весу) замораживали в жидком азоте, разрушали механически. Кле-точносвязанные ферменты из гомогената экстрагировали 10 мл Н20 на качалке в течение 1.5 ч.
Таблица 1. Влияние различных источников углерода на образование глюкозооксидазы мутантными штаммами Р. ип1си1озит
Источник углерода (4%) P. funiculosum БИМ F-15.3 P. funiculosum НММ95.132 P. funiculosum 46.1
рН Биомасса, мг/мл Глюкозооксидаза рН Биомасса, мг/мл Глюкозооксидаза рН Биомасса, мг/мл Глюкозооксидаза
ед/мл ед/мг ед/мл ед/мг ед/мл ед/мг
Глюкоза 3.5 3.5 3.34 0.95 3.5 2.9 4.4 1.53 3.7 5.6 2.88 0.52
Ксилоза 4.8 2.3 1.53 0.66 5.5 4.7 0.80 0.17 5.6 4.4 0.62 0.14
Фруктоза 4.3 2.4 4.10 1.74 4.8 3.2 6.25 1.94 5.2 5.3 1.57 0.29
Лактоза 5.2 1.3 следы следы 6.4 1.9 следы следы 6.9 1.5 следы следы
Мальтоза 4.1 6.1 0.58 0.10 5.2 9.1 0.98 0.11 3.7 5.6 2.83 0.51
Сахароза 3.5 3.1 5.05 1.64 3.5 4.4 8.23 1.86 3.4 5.4 9.14 1.98
Глицерин 6.4 2.4 следы следы 7.0 2.5 следы следы 7.0 3.8 следы следы
Маннит 5.2 3.1 1.63 0.52 4.3 5.1 2.36 0.39 5.5 3.2 1.15 0.36
После центрифугирования экстрактов (8000 об/мин, 15 мин) в надосадочной жидкости определяли активность глюкозооксидазы и каталазы, которую выражали в ед/мг сухой биомассы.
Влияние источников углеродного питания на рост мутантных штаммов Р. Уип1си1озит и синтез глюкозооксидазы изучали при использовании моно- и дисахаров, сахароспиртов.
Активность глюкозооксидазы определяли спектрофотометрическим методом, основанным на энзиматическом превращении бензохинона в гидрохинон [6].
Активность каталазы - титрометрически [7].
При измерении активности инвертазы составляли реакционную смесь, содержащую 2 мл 0.2 М Ка-ацетатного буфера (рН 4.9), 1 мл 0.5 М сахарозы, 0.8 мл ферментного раствора. В контроле вместо сахарозы использовали 1 мл дистиллированной воды. Длительность инкубирования - 10-20 мин при 30°С. За единицу инвертазной активности принимали такое количество фермента, которое гидролизует сахарозу с образованием 1 ммоль редуцирующих веществ за 1 мин при 30°С.
Активность внеклеточных ферментов выражали в ед/мл культуральной жидкости и ед/мг абсолютно сухой биомассы (продуцирующая способность мицелия).
Количество редуцирующих веществ анализировали с 3.5-динитросалициловой кислотой [8]. Фруктозу идентифицировали количественно цис-теин-карбазольным методом [9]. рН определяли потенциометрически.
Реакционная смесь для определения перекиси водорода содержала: 0.8 мл культуральной жидкости, 0.175 мл дистиллированной воды, 0.98 мл 0.1 М цитратно-фосфатного буфера (рН 3.6), 0.04 мл 0.1 М раствора о-фенилендиамина, 0.005 мл 8.0 х 10-7 М пероксидазы (или Н20 в контроле).
Время реакции - 1 мин. Замер оптической плотности проводили на спектрофотометре СФ-46 (к = 455 нм). Концентрацию Н202 определяли по калибровочной зависимости.
Удельные скорости роста грибов (ц) и синтеза глюкозооксидазы (е) рассчитывали по формулам: ц = -dddx- , е = <ddE- ; где х - биомасса (мг/мл), dt -^ dtx dtx
промежуток времени (ч), dx - прирост биомассы (мг/мл), dE - прирост активности (ед/мл) [10].
Приведенные данные есть среднее значение результатов не менее трех опытов, выполненных в трех повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ литературных данных показал, что биосинтез глюкозооксидазы мицелиальными грибами зависит от компонентов питательной среды и особенно от источника углерода. Использование в этом качестве глюкозы наиболее эффективно для образования фермента грибами Alternarla alternata [11], Aspergillus niger [12], Pénicillium variabile [13], P. notatum [14] и Talaromyces flavus [15]. Для некоторых культур максимальный уровень синтеза глюкозооксидаз обеспечивался использованием в качестве источника углерода сахарозы, мелассы или крахмала [16, 17].
Согласно результатам, представленным в табл. 1, мутантные штаммы P. funiculosum продуцировали глюкозооксидазу при росте на средах со всеми испытанными источниками углерода, что позволяет предположить конститутивный характер образования фермента. Для синтеза глюкозо-окисляющего фермента грибами оптимальными были: сахароза, глюкоза, фруктоза, кроме того, ксилоза, маннит (P. funiculosum БИМ F-15.3), мальтоза (P. funiculosum 46.1). Максимальный уровень образования глюкозооксидазы мутант-
ными штаммами установлен при их выращивании на среде с сахарозой. Следовые количества фермента, обнаруживаемые при культивировании грибов на среде с лактозой, связаны со слабым ростом культур. Незначительную продукцию глюкозооксидазы мутантными штаммами при использовании глицерина в качестве источника углерода можно объяснить снижением кислотности питательной среды в процессе культивирования. Это подтверждают и результаты других исследователей, показавшие, что оптимальное значение рН для образования данного фермента большинством грибов находится в пределах 5.0-5.5 [13, 16].
Дальнейшие исследования роста штаммов Р. funiculosum и образования ими ферментов проводили в условиях глубинного культивирования грибов на среде с сахарозой в качестве единственного источника углерода. Известно, что мицели-альные грибы для метаболизирования сахарозы продуцируют инвертазу, под действием которой в результате гидролиза дисахарида образуются глюкоза, фруктоза и небольшое количество фруктозосодержащих олигосахаридов [18]. Синтез этого фермента Р. funiculosum БИМ Б-15.3 и НММ95.132 наиболее активно протекал в лаг-фазе роста культур, начиная с 6 ч ферментации (рис. 1). Соотношение между моносахарами, образуемыми в течение ферментации, постоянно менялось. Как видно из табл. 2, в первые часы выращивания грибов происходило интенсивное потребление глюкозы. Максимальное накопление редуцирующих веществ (глюкозы и фруктозы) наблюдалось к 52 ч роста культур. К 96 ч ферментации Р. ^тс-ulosum БИМ Б-15.3 и НММ95.132 в среде оставалось 16 и 21 мг/мл редуцирующих веществ, соответственно, из них фруктозы - 9.7-9.86 мг/мл.
Анализ роста мутантных штаммов и синтеза глюкозоокисляющего фермента показал, что
ед/мл
Рис. 1. Образование инвертазы Р. funiculosum БИМ
Б-15.3 (1), НММ95.132 (2), 46.1 (3).
биомасса Р. funiculosum БИМ Б-15.3 и НММ95.132 интенсивно накапливалась с 18 ч культивирования, следовые количества внеклеточной глюко-зооксидазы обнаруживались на 30-м ч ферментации, наибольшее же количество фермента в куль-туральной жидкости (5.4 и 12.08 ед/мл)
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.