научный журнал по биологии Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии ISSN: 0233-4755

БАТУРИНА Г.С., ИЛЯСКИН А.В., КАТКОВА Л.Е., СОЛЕНОВ Е.И. — 2013 г.

Регуляция водной проницаемости главных клеток эпителия собирательных трубок нейрогипофизарным гормоном вазопрессином лежит в основе функции почки как основного эффекторного органа в поддержании водно-солевого гомеостаза организма. Важным звеном механизма антидиуретического действия вазопрессина является клатрин-зависимый эндоцитоз водных каналов и рецепторов вазопрессина V2. Интернализация рецепторов может не только приводить к снижению количества рецепторов в плазматической мембране, но и активировать альтернативные пути передачи сигнала. В обзоре обобщены сведения о механизме клатрин-зависимого эндоцитоза рецепторов V2 и водных каналов (AQP2), что необходимо для более глубокого понимания процессов, лежащих в основе антидиуретического действия вазопрессина.

АПЕЛЬ Х.-Ю., СОКОЛОВ В.С., ТАШКИН В.Ю., ЩЕРБАКОВ А.А. — 2013 г.

Изучены изменения емкости и проводимости бислойной липидной мембраны с адсорбированными на ней фрагментами мембран, содержащих Na+,K+-ATP-азу, вызванные быстрым освобождением протонов из связанного состояния (Caged-H+) под действием вспышки ультрафиолетового света. В присутствии Na+,K+-ATP-азы изменения емкости и проводимости зависели от частоты приложенного напряжения, рН и концентрации ионов натрия. Добавление ионов натрия влияло на изменение емкости, вызванное закислением среды при фотолизе Caged-H+, причем величина и знак эффекта натрия зависели от исходного рН. Эти результаты объясняются конкурентным связыванием ионов натрия и протонов в активном центре Na+,K+-ATP-азы с цитоплазматической стороны мембраны. Значение рН, при котором эффект ионов натрия меняет знак, позволило определить значение рК центра связывания протонов, равное примерно 7.6.

ЗИНЧЕНКО В.П., КОНОНОВ А.В., ТУРОВСКАЯ М.В., ТУРОВСКИЙ Е.А. — 2013 г.

Известно, что кратковременные эпизоды гипоксии защищают нейроны от гибели при глобальной гипоксии и ишемии (гипоксическое прекондиционирование). Эти же воздействия вызывают постгипоксическую гипервозбудимость в период реоксигенации, что может привести к гибели отдельных популяций нейронов, отличающихся повышенной чувствительностью к гипоксии. В настоящей работе сравнили действие кратковременной гипоксии на развитие эффектов прекондиционирования и постгипоксической гипервозбудимости в двух популяциях нейронов: тормозных ГАМКергических и возбуждающих глутаматергических. Эффект прекондиционирования оценивали по степени подавления активности NMDA-рецепторов. Постгипоксическую гипервозбудимость регистрировали по появлению спонтанного синхронного Са2+-спайка в нейрональной сети в период реоксигенации после каждого эпизода гипоксии. Показано, что эффект прекондиционирования развивается только в глутаматергических нейронах и отсутствует в ГАМКергических. Активность NMDA-рецепторов в этих нейронах не подавляется, а возрастает после каждого эпизода гипоксии. В момент генерации постгипоксического синхронного Ca2+-спайка в части ГАМКергических нейронов происходит глобальное повышение базального уровня Са2+ с последующей их гибелью. Противовоспалительный цитокин интерлейкин-10 (ИЛ-10) препятствует развитию постгипоксической гипервозбудимости, ингибируя спонтанный синхронный Са2+-спайк, и защищает ГАМКергические нейроны от гибели, восстанавливая в них эффект прекондиционирования. Ингибиторы PI3-киназы – вортманнин и LY294.002 – препятствуют развитию защитного эффекта ИЛ-10, отменяя ингибирующий эффект ИЛ-10 на генерацию спонтанного синхронного Ca2+-спайка. Полученные данные указывают на ведущую роль ГАМКергических нейронов в развитии постгипоксической гипервозбудимости. Предполагается, что возникновение гипервозбудимости в нейрональной сети обусловлено ослаблением тормозного влияния ГАМКергических нейронов. Активация различных сигнальных путей, ведущих к росту фосфорилирования, зависящего от протеинкиназ B и G, в нейронах этого типа является возможной стратегией защиты нервных клеток при гипоксии.

ВОЛОШИНА Е.В., КОСЯКОВА Н.И., ПРОХОРЕНКО И.Р. — 2013 г.

Тяжесть патологического процесса при грамотрицательном сепсисе зависит от интенсивности ответа клеток крови человека на структурные компоненты бактерий – липополисахариды (ЛПС). Результатом этого ответа является генерализованная воспалительная реакция организма, обусловленная повышенной продукцией провоспалительных цитокинов. Один из разрабатываемых сегодня подходов к предупреждению развития воспалительной реакции – блокирование связывания ЛПС с рецепторами клеток-мишеней. Нами изучена эффективность антагонистического действия ЛПС из Rhodobacter capsulatus в отношении токсичных ЛПС из Salmonella typhimurium и из Escherichia coli, оцениваемая по синтезу провоспалительных цитокинов TNF- , IL-6 и IL- . R. capsulatus в концентрации 0.1 и 1 мкг/мл не обладал способностью индуцировать синтез TNF- , IL-6 и IL- . Измерение уровня цитокинов показало, что ЛПС из R. capsulatus защищают от действия токсичных ЛПС. Более выраженное антагонистическое действие ЛПС из R. capsulatus проявлял в отношении ЛПС из S. typhimurium: наблюдалось полное блокирование синтеза TNF-a и IL- и значительное снижение уровня IL-6. ЛПС из R. capsulatus проявлял свойства антагониста и в отношении ЛПС из E. сoli: наработка TNF- полностью подавлялась, уровень IL-6 снижался на 60%, а IL- – на 70%. Таким образом, ЛПС из R. capsulatus способен в разной степени блокировать активацию клеток токсичными ЛПС.

АТАУЛЛАХАНОВ Ф.И., КАЛЯГИНА Н.В., МАРТЫНОВ М.В. — 2013 г.

Математическая модель регуляции ионного обмена и объема эритроцитов человека дополнена в настоящей работе биомеханической моделью оболочки эритроцита. С помощью построенной модели проанализировано влияние упругих свойств оболочки эритроцита на его объем в экспериментах, где объем эритроцита увеличивался вследствие образования ионных каналов в мембране после обработки амфотерицином В и в случае помещения эритроцитов в гипоосмотическую среду. Показано, что при деформировании эритроцита с сохранением постоянной площади поверхности вплоть до сферического состояния влияние механических свойств оболочки на регуляцию объема пренебрежимо мало по сравнению с влиянием ионного обмена. Дальнейшее осмотическое набухание эритроцита, сопровождаемое увеличением площади его поверхности, определяется жесткостью на растяжение оболочки. Высокое значение жесткости на растяжение, свойственное оболочке эритроцита, является сдерживающим фактором для изменения его объема и воздействует на ионный обмен.

ВОДЕНЕЕВ В.А., КАЛИНИН В.А., СУРОВА Л.М., СУХОВ В.С., ШЕРСТНЕВА О.Н. — 2013 г.

Н+-сахарозный симпортер играет важную роль в загрузке сахарозы из апопласта в ситовидные элементы, что является одним из начальных этапов дальнего транспорта углеводов по растению. Для понимания механизмов такого транспорта необходимы не только экспериментальные, но и теоретические исследования, в частности, разработка оптимальной математической модели Н+-сахарозного симпортера. В представленной работе для качественного и количественного описания транспорта углеводов проведен сравнительный анализ эффективности моделей симпортера с одним, двумя, четырьмя и шестью состояниями. Предложенные модели Н+-сахарозного симпортера для корректного их сравнения с экспериментальными данными описаны в рамках более общей модели транспорта сахарозы в везикуле плазматической мембраны. Теоретический анализ показал, что при использованных в работе значениях параметров все четыре варианта модели различной степени детализации хорошо описывают экспериментальную динамику и абсолютную величину выхода сахарозы из инвертированной везикулы, а также изменения мембранного потенциала. На основании полученных результатов сделано заключение, что оптимальной, по крайней мере для анализа транспорта на везикулярном уровне, является наиболее простая модель, учитывающая лишь одно состояние фермента.

ВАЛИУЛЛИНА Ф.Ф., КОРОЛЕВА К.С., ХАЗИПОВ Р.Н., ЯКОВЛЕВ А.В. — 2013 г.

Мембранный потенциал покоя – фундаментальный параметр, определяющий функциональные свойства нейронов. Нейроны таламуса функционируют в режиме вспышечной или тонической активности в зависимости от их мембранного потенциала, что определяет способ передачи сенсорной информации через таламус от сенсорного органа в кору головного мозга, а также генерацию различных типов активности в таламокортикальных сетях. Считается, что у новорожденных крысят нейроны таламуса деполяризованы (значения мембранного потенциала около –50 мВ) и, следовательно, находятся в состоянии постоянной тонической активности. Однако эти данные получены при регистрации нейронов таламуса с помощью пэтч-кламп-регистрации в конфигурации “целая клетка” (whole-cell), при которой, как известно, возможна искусственная деполяризация клеток в результате шунтирования мембраны через контакт между электродом и мембраной. В настоящей работе значения мембранного потенциала были измерены с использованием менее инвазивной методики – регистрации одиночных ионных каналов в конфигурации “на клетке” (cell-attached). Основываясь на потенциале реверсии токов через NMDA-каналы, определили значение мембранного потенциала в вентропостериомедиальных нейронах 2–7-дневных крысят, который составил около –74 мВ. Эти данные позволили предположить, что в состоянии покоя нейроны таламуса новорожденных крысят не деполяризованы и находятся скорее во вспышечном, нежели в тоническом состоянии активности. Обсуждается значимость этих наблюдений для процессов передачи сенсорных сигналов через таламус и генерации ранних таламокортикальных паттернов активности, в частности, веретенообразных вспышек активности.

КУЧИН А.В., ПЛЮСНИНА С.Н., ФЕДОРОВА И.В., ЧУКИЧЕВА И.Ю., ШЕВЧЕНКО О.Г., ШИШКИНА Л.Н. — 2013 г.

Изучены мембранотропные и мембранопротекторные свойства, а также антиоксидантная активность ряда новых полусинтетических антиоксидантов – изоборнилфенолов (терпенофенолов). О цитотоксических и мембранопротекторных свойствах соединений судили по степени спонтанного и индуцированного пероксидом водорода гемолиза эритроцитов. Показано, что все рассмотренные соединения при определенных условиях могут проявлять выраженную антиоксидантную активность, тогда как способность защищать мембрану эритроцитов от окислительного стресса существенно зависит от структуры соединения и его концентрации. Наибольшую мембранопротекторную активность проявил 2,6-диизоборнил-4-метилфенол, имеющий изоборнильные заместители в обоих орто-положениях. Изучение поверхностной архитектоники эритроцитов методом сканирующей электронной микроскопии подтвердило способность данных соединений взаимодействовать с мембраной и изменять ее структурное состояние. Выявлена взаимосвязь между характером морфологической трансформации эритроцитов, связанным, в соответствии с гипотезой сопряженного бислоя, с особенностями распределения соединений в плазматической мембране, и цитотоксичностью высоких концентраций ряда изоборнилфенолов, обусловливающей их низкую мембранопротекторную активность в модельной клеточной системе. Сделан вывод, что биологическая активность изоборнилфенолов обусловлена как их антиоксидантными свойствами, так и способностью взаимодействовать с мембраной.

АБДУЛЛИН Т.И., БАДЕЕВ Ю.В., БОНДАРЬ О.В., САГИТОВА А.В., ШТЫРЛИН Ю.Г. — 2013 г.

Получены и охарактеризованы конъюгаты блок-сополимеров этилен- и пропиленоксида (плуроников L61 и L121) с янтарной кислотой. Проведено сравнительное изучение взаимодействия полимеров с мембранами клеток человека (клетки линии HeLa и A549). Адсорбция плуроника L121 на клеточной поверхности сопровождается уменьшением, а конъюгатов L61 и L121 – увеличением отрицательного дзета-потенциала клеток. Инкубация клеток с плурониками в буферном растворе приводит к увеличению проницаемости плазмалеммы для пропидия йодида и ионов; влияние полимеров повышается в ряду: L61, конъюгаты L121/L61, L121. Плуроник L61 при его культивировании с клетками вызывает уменьшение мембранного потенциала митохондрий, не наблюдаемое для L121. Конъюгаты плуроников не так существенно влияют на мембранный потенциал митохондрий, как плуроники, и отличаются меньшей цитотоксичностью, вероятно, вследствие замедления внутриклеточного транспорта модифицированных полимеров. Полученные результаты представляют интерес для разработки безопасных и эффективных систем доставки биологически активных веществ в клетки на основе плуроников.

КОКОЗ Ю.М., МАЛЬЦЕВ А.В. — 2013 г.

В настоящей работе исследовались спонтанные Са2+-волны в изолированных кардиомиоцитах крыс. Установлено, что генерация спонтанных Са2+-волн в сердечных клетках может не сопровождаться сокращениями кардиомиоцитов. Са2+-волны полностью подавлялись в присутствии рианодина – ингибитора рианодиновых рецепторов (RyRs), в то время как селективный ингибитор IP3 рецепторов (IP3Rs) ксестоспонгин С кратковременно снижал частоту осцилляций. Это свидетельствует о том, что основной вклад в спонтанные осцилляции внутриклеточного Са2+ вносит Са2+-индуцированное высвобождение депонированного Са2+ через RyRs-каналы. Блокатор Na+/Са2+-обменника KB-R7943 не влиял ни на частоту, ни на амплитуду спонтанных Са2+-волн, что указывает на незначительный вклад Na+/Са2+-обмена в их генерации. Существенное снижение частоты и амплитуды Са2+-волн наблюдалось при уменьшении внеклеточной концентрации Са2+ до 1 мкМ, что свидетельствовало о том, что генерация Са2+-волн сопровождается входом наружного Са2+. Предлагается детальная классификация спонтанных Са2+-волн и рассматривается вопрос о возможности использования изолированных кардиомиоцитов, генерирующих волны устойчивого типа, для количественной оценки внутриклеточного уровня Ca2+ и анализа механизмов возбудимости сердечных клеток.

АРТАМОНОВ Д.Н., БЕЗПРОЗВАННЫЙ И.Б., ВЛАСОВА О.Л., ВУ Д., ИМ К., КОРЖОВА В.В., КРАСНОБОРОВА В.А., РЫБАЛЬЧЕНКО П.Д. — 2013 г.

Болезнь Хантингтона (БХ) – тяжелое наследственное нейродегенеративное заболевание, неизлечимое в настоящее время. Одной из основных причин развития этого заболевания считается нарушение кортикостриатных связей, приводящее к характерным моторным нарушениям. В данной работе синаптическая передача между нейронами коры и стриатума изучена на смешанной кортикостриатной культуре нейронов, использованной в качестве модели БХ. Культура нейронов получена из головного мозга мышей линии YAC128 с генетической мутацией, вызывающей болезнь Хантингтона. Первые нарушения отмечены уже на 14 день культивирования: нейроны коры культуры YAC128 отличаются повышенной спонтанной активностью по сравнению с культурой нейронов дикого типа. В то же время на 14 день морфологическое состояние дендритного дерева стриатных нейронов в модели БХ было нормальным, однако применение оптогенетического подхода показало, что уже в это время нарушаются синаптические контакты. К 19 дню культивирования активность кортикальных нейронов YAC128 опускается ниже нормы, что приводит к нарушениям на постсинаптической стороне – элиминации и морфологическим изменениям дендритных шипиков, которые, вероятно, приводят к нейродегенеративным процессам в ходе развития БХ.

БЕСПАЛОВА Ж.Д., ГОРБАЧЕВА Л.Р., ПИНЕЛИС В.Г., САВИНКОВА И.Г., СТРУКОВА С.М. — 2013 г.

Протеиназы гемостаза могут появляться в ткани мозга при травме и воспалении в результате нарушения целостности гематоэнцефалического барьера. Сериновые протеиназы регулируют функции клеток через трансмембранные рецепторы, активируемые протеиназами (PARs), сопряженные с G-белками. Протеиназы расщепляют одну пептидную связь экзодомена рецептора, что приводит к образованию нового N-конца (“привязанного лиганда”), который обладает способностью специфически взаимодействовать со второй внеклеточной петлей молекулы рецептора и активировать его. Для цитопротекторного действия активированного протеина С (АРС) на эндотелиальных клетках и нейронах необходимы два типа рецепторов – EPCR и PAR1. АРС, активируя PAR-1, контролирует экспрессию генов провоспалительных и про-апоптотических факторов, оказывает протекторное действие на нейроны в условиях стресса и на эндотелий мозга при гипоксиии, а также стабилизирует эндотелиальный барьер. Мы предположили, что пептиды-аналоги “привязанного лиганда” PAR1, освобождаемого АРС, могут оказывать нейропротекторное действие, подобное действию АРС. Для моделирования ишемического повреждения мозга мы использовали модель глутаматной эксайтотоксичности на первичной культуре гиппокампальных нейронов новорожденных крысят. Исследованные пептиды NPNDKYEPF-амид (пептид-9) и NPNDKYEPFWE (пептид-11) более эффективно снижали уровень апоптоза в нейронах при эксайтотоксичности, чем АРС, при этом влияние на количество живых и некротических клеток при действии пептидов было аналогично эффектам АРС. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что протекторное действие этих пептидов-аналогов “привязанного лиганда” PAR1 сопоставимо с защитным действием АРС при глутаматной эксайтотоксичности. Исследование механизмов действия пептидов-агонистов PAR1, а также разработка их модифицированных укороченных версий с высокой нейропротекторной активностью может быть актуальным направлением в поиске новых нейропротекторных препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний и инсультов.

БЕЛОСЛУДЦЕВА Н.В., МИРОНОВА Г.Д., МОШКОВ Д.А., ПАВЛИК Л.Л., ТАЛАНОВ Е.Ю., ШИГАЕВА М.И. — 2013 г.

Проведено электронно-микроскопическое исследование срезов ткани печени и сердца крыс с использованием первичных коммерческих антител к KIR6.2 и вторичных антител, коньюгированных с коллоидным золотом. Обнаружено, что меченный гранулами золота белок локализован в митохондриях кардиомиоцитов и гепатоцитов, но отсутствует в шероховатом и гладком эндоплазматическом ретикулуме клеток печени, а также в миофибриллах миокарда. В митохондриях сердца и печени гранулы золота располагались преимущественно в кристах, и не были выявлены в митохондриальном матриксе и межмембранном пространстве. Эти данные свидетельствуют о том, что митохондрии сердца и печени содержат белок, близкий по структуре к каналообразующей субъединице цитоплазматического калиевого канала, KIR6.2. На это указывает также наличие общих модуляторов ATP-зависимых калиевых каналов, цитоплазматических и митоходриальных. Обсуждается возможная роль изучаемого белка в качестве канальной субъединицы ATP-зависимого калиевого канала митохондрий.

БРЕВНОВ В.В., ИНДЕНБОМ А.В., ФЕДОРОВА Н.В. — 2013 г.

Методом рефрактометрии поверхностного плазмонного резонанса исследована адсорбция вирусного матриксного белка М1 на химически привитом к поверхности золота слое молекул карбоксигексадекантиола, моделирующем поверхность клеточной мембраны. Показано, что в кислой среде (при рН 4.0) доля необратимо адсорбированного белка увеличивается со временем. В интервале концентраций от 50 до 500 нМ белок формирует на поверхности монослой. Обнаружено, что в этом диапазоне концентраций количество адсорбированного белка увеличивается более чем в 3 раза. Важной особенностью является то, что даже при самых малых концентрациях молекулы М1 полностью занимают всю поверхность подложки, и дополнительная его добавка не приводит к дальнейшей адсорбции. Для объяснения обнаруженных явлений сделано предположение, что в ходе адсорбции число связей между молекулой М1 и поверхностью увеличивается, приводя к ее распластыванию. По-видимому, этот эффект обусловлен слабоупорядоченной структурой С-домена белка. Высказана гипотеза о том, что распад белок-липидной оболочки вириона гриппа в кислой среде происходит не в результате десорбции М1, а обусловлен ослаблением межбелковых связей.

ДУБИНИН М.В., РЫБАКОВА С.Р., САМАРЦЕВ В.Н. — 2013 г.

Установлено, что -тетрадекандиоловая кислота (ТДК) в концентрации 0–500 мкМ дозозависимо увеличивает (до 2 раз) скорость несопряженного с синтезом АТР дыхания (свободное окисление) митохондрий печени. Этот эффект ТДК наблюдается в присутствии избытка EGTA, что исключает индукцию Са2+-зависимой неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий (открытие поры). Циклоспорин А, добавленный к митохондриям в необычной для него высокой концентрации (10 мкМ), как до, так и после ТДК, полностью устраняет этот эффект. Действие ТДК в отличие от других активаторов свободного окисления – протонофорного разобщителя n-трифторометоксикарбонилцианидфенилгидразона и пальмитиновой кислоты, не сопровождается ингибированием окислительного синтеза АТР и уменьшением коэффициента ADP/O. Показано, что ингибитор Н+—синтазы олигомицин, а также ADP, АТР и Pi не влияют на активность ТДК. Это свидетельствует о том, что эффект ТДК не связан с воздействием на Н+—синтазу и отличается от эффекта мембранотропных разобщителей. В присутствии липофильного катиона тетрафенилфосфония (ТФФ+) циклоспорин А не влияет на стимулированное ТДК дыхание митохондрий, а карбоксиатрактилат и глутамат, добавленные после ТДК, ингибируют дыхание. Кроме того, в этих условиях ТДК снижает скорость окислительного синтеза АТР и уменьшает коэффициент ADP/O. Таким образом, в присутствии ТФФ+ влияние ТДК на митохондрии сходно с разобщающим действием монокарбоновых жирных кислот и, по-видимому, осуществляется при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров. Предполагается, что в отсутствие ТФФ+ свободное окисление в митохондриях печени ТДК активируется по механизму действия так называемых десопрягающих агентов и связано с переключением работы комплексов дыхательной цепи на холостой режим (внутреннее разобщение).

ГАРНЮК В.В., ГОНЧАРОВ Н.В., КУДРЯВЦЕВ И.В., НАДЕЕВ А.Д. — 2013 г.

Цель работы состояла в определении иммунологического фенотипа эндотелиальных клеток пупочной вены человека в культуре и динамики экспрессии индуцибельных поверхностных CD-молекул этих клеток при воздействии экзогенного пероксида водорода (H2O2, 100–300 мкМ) in vitro. В качестве положительного контроля использован форболовый эфир. Через 3 ч после воздействия наблюдалось незначительное (9–21%) повышение плотности экспрессии CD31 при всех концентрациях добавленного H2O2, статистически значимое снижение экспрессии CD309 (15–20%) отмечено при воздействии 200 и 300 мкМ Н2О2. Через 1 сут уровень CD54 повышался существенно и дозозависимо, а экспрессия всех исследованных CD-молекул умеренно усиливалась.

АРСЕНЬЕВ А.С., БОЧАРОВ Э.В., БОЧАРОВА О.В., ДУБИННЫЙ М.А., МИНЕЕВ К.C., МИШИН А.В. — 2013 г.

Рецепторные тирозинкиназы – интегральные мембранные белки, которые активируются при латеральной гомо- или гетеродимеризации, осуществляемой с участием их трансмембранного домена. Рецепторные тирозинкиназы играют важную роль в передаче межклеточного сигнала, а полиморфизм и мутации в их трансмембранных доменах ассоциированы с рядом заболеваний человека. Семейство рецепторов эпидермального фактора роста, ErbB, представляет собой важный класс рецепторных тирозинкиназ, которые участвуют в процессах роста, развития и дифференцировки клеток человека. В настоящей работе для изучения влияния патогенных мутаций на структурно-динамические свойства и специфическое взаимодействие трансмембранных доменов рецепторов семейства ErbB созданы высокоэффективные системы бактериальной экспрессии и очистки рекомбинантных трансмембранных фрагментов ErbB2641-684 с проонкогенными заменами остатка Val659 на остатки Glu или Gln. Трансмембранные фрагменты нарабатывали в клетках Escherichia coli BL21(DE3)pLysS в составе гибрида с тиоредоксином А. Протокол выделения и очистки включает металлохелатную аффинную и катионообменную хроматографии. Использование тромбина для гидролиза гибридного белка позволяет снизить финансовые затраты по сравнению с аналогичными протоколами. Описанные методики позволяют получить миллиграммовые количества мутантных трансмембранных фрагментов ErbB, а также их изотопно-меченых производных для структурных исследований методом гетероядерной спектроскопии ЯМР высокого разрешения в мембраноподобном окружении.

ПАРНОВА Р.Г., ФЕДОРОВА Е.В., ФОК Е.М. — 2013 г.

Липидные тельца (ЛТ) – динамические клеточные органеллы, вовлеченные в различные процессы клеточного метаболизма и внутриклеточной сигнализации. Их ядро состоит, главным образом, из триацилглицеринов (ТАГ) и эфиров холестерина (ЭХ). Работа посвящена использованию проточной цитометрии для количественного анализа изменения уровня липидов, окрашенных флуоресцентным красителем нильским красным (НК), в ЛТ эпителиальных клеток. Объектом исследования служили нефиксированные свежевыделенные эпителиальные клетки мочевого пузыря лягушки Rana temporaria, обладающие мелкими, диффузно локализованными в цитоплазме ЛТ. В качестве экспериментальных воздействий использовали арахидоновую кислоту (АК), известного стимулятора образования ЛТ, и метил- -циклодекстрин ( ЦД), применяемого для селективного извлечения холестерина из липидных рафтов плазматической мембраны. Клетки инкубировали с 10–50 мкМ АК в течение 1 ч или с 400–2000 мкМ ЦД в течение 30 мин, после чего окрашивали НК и определяли флуоресценцию ( возб = 488 нм, эм = 575 ± 15 нм) на проточном цитометре; в этих же клетках анализировали боковое светорассеяние (SS). Инкубация клеток с АК дозозависимо увеличивала флуоресценцию НК. Эффект при использовании максимальной концентрации АК составил 41 ± 2.2% и 15 ± 3.4% (p < 0.001) для флуоресценции НК и величины SS соответственно. Анализ содержания липидных классов в клеточных экстрактах выявил увеличение в присутствии 10 мкМ АК соотношения ТАГ к холестерину в 1.7 раза, к фосфолипидам – в 1.8 раза (p < 0.001). ЦД, начиная с концентрации 400 мМ, дозозависимо снижал флуоресценцию НК и величину SS, его эффект при использовании этой дозы сопровождался уменьшением относительного уровня холестерина на 6% (p < 0.01) и эфиров холестерина на 21% (p < 0.001). Это свидетельствует о расходовании ЭХ из ЛТ при потере холестерина из липидных рафтов плазматической мембраны. Таким образом, используя вещества, оказывающие противоположные влияния на ЛТ, и действующие на разные классы нейтральных липидов, содержащихся в ЛТ, мы показали, что проточная цитометрия с использованием НК позволяет быстро, с большой чувствительностью и хорошей воспроизводимостью регистрировать как накопление липидов в небольших по размеру ЛТ, так и уменьшение их уровня в живых клетках, не специализированных на создании жирового депо.

БЕРЕЖНОВ А.В., ЗИНЧЕНКО В.П., КОНОНОВ А.В., ФЕДОТОВА Е.И. — 2013 г.

Предложен способ качественного и количественного анализа эффектов соединений, взаимодействующих с глутаматными NMDA-, AMPA-, и KA-рецепторами, с использованием неинвазивного метода микрофотометрии. Метод основан на регистрации активности лиганд- и потенциал-зависимых кальциевых каналов с применением двухволнового флуоресцентного зонда Fura-2. Подобраны условия, при которых повторное кратковременное (до 30 с) воздействие агонистов NMDA-, АМРА- и КА-рецепторов вызывает в большинстве клеток кальциевый ответ, практически идентичный первому, что дает возможность использовать реакцию клетки на первую аппликацию лиганда в качестве контроля. Последнее позволяет получать статистически репрезентативные кривые доза–ответ, усредненные по большой популяции клеток. С целью повышения чувствительности метода для каждого лиганда определен возраст культуры, оптимальный для проведения эксперимента. С целью сравнения результатов различных экспериментов и получения более точных значений констант активации и ингибирования введены определенные правила нормирования сигналов. Показано, что вариабельность кальциевых ответов однотипных индивидуальных нейронов на агонисты глутаматных рецепторов во многом обусловлена степенью и кинетикой их десенситизации. Для характеристики лигандов АМРА- и КА-рецепторов опыты проводили в присутствии ингибиторов десенситизации – циклотиазида и конканавалина A, соответственно, которые увеличивали амплитуду ответов и превращали импульсные ответы на агонисты в ступенчатые. Разработанный метод позволяет обнаружить в составе неизвестного образца лиганды исследуемых рецепторов, определить дозы полуактивации и полуингибирования, а также тип ингибирования. Метод сочетает высокую чувствительность, специфичность и производительность, обусловленную возможностью одновременного неинвазивного анализа индивидуальной активности сотен клеток. Методика применима как для получения характеристик, усредненных по всем исследуемым нейронам, так и для выбранных субпопуляций клеток и одиночных нейронов.

АМЕРХАНОВ З.Г., КОМЕЛИНА Н.П. — 2013 г.

Функциональная роль митохондриальных разобщающих белков, гомологов UCP1 из бурой жировой ткани, остается неясной. Недавно предположили, что у животных UCP2 и UCP3 действуют как метаболические триггеры, способные переключать углеводный метаболизм на жировой, откачивая пируват из митохондрий. Мы проверили данную гипотезу, используя в качестве объекта зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus, у которых в зимний период повышается содержание UCP в тканях, и присутствует UCP1 в развитой бурой жировой ткани. Нами подтверждена принципиальная возможность неспецифического транспорта пирувата с участием UCP1 в митохондриях бурой жировой ткани, предпринята попытка идентифицировать такой транспорт в митохондриях печени и скелетных мышц сусликов. Показано, что в препаратах митохондрий из бурого жира можно наблюдать транспорт пирувата, опосредованный UCP1, по GDP-чувствительному набуханию митохондрий, индуцированному валиномицином в 55 мМ калиевой соли пирувата. В аналогичных условиях в препаратах митохондрий печени и скелетных мышц зимних сусликов мы не обнаружили сколько-нибудь заметный электрогенный транспорт анионов пирувата, который можно связать с функционированием UCP2 и UCP3. В то же время, электронейтральный транспорт пирувата, осуществляемый классическим митохондриальным переносчиком пирувата, регистрируется по набуханию в пирувате калия, индуцированному валиномицином или нигерицином, и ингибируется его специфическим ингибитором -. Таким образом, нами показано, что в митохондриях печени и скелетных мышц зимних сусликов UCP2 и UCP3 не способны транспортировать пируват в отличие от UCP1 из бурой жировой ткани.