научный журнал по химии Биоорганическая химия ISSN: 0132-3423

БАРАНОВА Н.А., ЕГОРОВ Н.С., ЗВОНАРЕВА Е.С., КОТОВА И.Б., КРЕЙЕР В.Г., ОСМОЛОВСКИЙ А.А. — 2015 г.

Выявлены различия воздействия внеклеточных протеаз Aspergillus ochraceus и A. terreus на белки плазменного гемостаза, заключающегося в инициации активации белков протромбинового комплекса. Обнаружено, что протеазы, образуемые A. ochraceus оказывают прямое воздействие на проферменты протеин С и фактор свертывания Х, а экзопротеаза A. terreus вызывает их активацию опосредованно, через стимуляцию системы калликреина. На примере A. terreus впервые показана способность внеклеточных протеаз микромицетов активировать прекаллекреин плазмы крови человека.

ЗАРАЙСКИЙ А.Г., ИВАНОВА А.С., МИНИН А.А., ТЕРЕШИНА М.Б., ШАНДАРИН И.Н. — 2015 г.

На модели регенерации хвостового плавника рыбы Danio rerio впервые установлено, что секретируемый белок – Ag1 – необходим для регенерации. Показано, что ампутация хвостового плавника индуцирует быструю активацию экспрессии гена этого белка в клетках раневого эпителия. Вместе с тем, ингибирование трансляции мРНК ag1 вызывает замедление регенерации. Результаты этой работы важны потому, что ген ag1 имеется только у низших, хорошо регенерирующих позвоночных, включая рыб и амфибий, но отсутствует у высших позвоночных, не способных к эффективной регенерации конечностей. Полученные данные свидетельствуют о том, что снижение потенциальной возможности регенерации у высших позвоночных, в том числе у человека, может объясняться исчезновением у них некоторых генов, важных для регенерации, в частности, гена ag1.

БЕЛОУСОВ В.В., БИЛАН Д.С., ЛУКЬЯНОВ С.А. — 2015 г.

Окислительно-восстановительные процессы играют ключевую роль в клетках любых организмов. Эти процессы подразумевают направленные потоки электронов, в переносе которых участвуют редокс-пары: соединения, представленные в клетке параллельно в окисленном и восстановленном состояниях, например, NAD+/NADH, NADP+/NADPH, GSSG/GSH. До недавнего времени изучение окислительно-восстановительных процессов в живых клетках было затруднено, что было связано с отсутствием подходящих методов. Генетически кодируемые флуоресцентные биосенсоры представляют собой новый инструмент для изучения биологических процессов, в том числе окислительно-восстановительных. Биосенсоры позволяют в режиме реального времени регистрировать мессенджеры, метаболиты и активность ферментов в живых системах различной сложности, от культивируемых клеток до трансгенных животных. В обзоре рассмотрены основные типы известных редокс-биосенсоров и примеры их использования.

КУКИНА Т.П., СИНИЦИНА О.И., ФРОЛОВА Т.С. — 2015 г.

Проведен синтез бетулиновой кислоты из экстракта внешней коры березы (Betula pendula), одним из промежуточных продуктов синтеза была бетулоновая кислота. Оба соединения выделены в чистом виде (95%). С помощью теста Эймса и SOS-хромотеста показано, что исследуемые образцы не обладают мутагенными или генотоксическими свойствами.

ЗЕЛЕНИХИН П.В., ИЛЬИНСКАЯ О.Н., КОЛПАКОВ А.И., МЮЛЛЕР Д., СОКУРЕНКО Ю.В., УЛЬЯНОВА В.В. — 2015 г.

Биназа – РНКаза Bacillus pumilus (ранее B. intermedius), – эндонуклеаза, которая деполимеризует РНК, расщепляя 3,5-фосфодиэфирную связь между гуанозин-3-фосфатом и 5-ОН-группой соседнего нуклеотида с образованием 2,3- гуанозинциклофосфатов в первом этапе каталитической реакции. Последующий гидролиз образующихся 2,3-сGMP до 3-фосфата высокоспецифичен и осуществляется медленно, в связи с чем возникает вопрос о времени существования данного позиционного изомера при каталитическом расщеплении РНК биназой и о его вкладе в противоопухолевую активность последней. В настоящей работе с помощью иммуноферментного анализа установлено, что при расщеплении РНК биназой 2,3-сGMP сохраняется в реакционной смеси в течение часа, при этом действие фосфодиэстраз не приводит к полной его элиминации. Количество 2,3-сGMP максимально при рН 8.5 и достигает наномолярных концентраций при исходной концентрации РНК 100–1000 мкг/мл. Экзогенный 2,3-сGMP, как и его позиционный изомер 3,5-сGMP, не вызывают апоптоз клеток аденокарциномы легких человека А549, подверженных апоптогенному действию биназы. Учитывая данные об интернализации биназы и активации открытия митохондриальных пор 2,3- гуанозинциклофосфатами, можно предположить, что в апоптоз, индуцированный биназой, 2,3-cGMP, способен внести вклад только при внутриклеточном его образовании.

БОРЗЕНКОВА А.В., ЕРЕМЕЕВ Н.Л. — 2015 г.

Проведена экспериментальная верификация метода изучения первичной специфичности протеолитических ферментов статистическим анализом масс продуктов протеолиза белковых субстратов на протеиназах с известной субстратной специфичностью (глутамилэндопептидаза и трипсин). Предлагаемый метод не требует прямого определения аминокислотной последовательности продуктов протеолиза, достоверно определяет протеиназы с узкой субстратной специфичностью и относительно толерантен к наличию в МАЛДИ масс-спектрах продуктов протеолиза пиков посторонних загрязнений. Показано, что для исключения ложноположительных результатов необходимо использовать набор белковых субстратов с последующим усреднением получаемых статистических данных.

ЗЛОБОВСКАЯ О.А., ЛУКЬЯНОВ К.А., САРКИСЯН К.С. — 2015 г.

Исследована возможность использования инфракрасного флуоресцентного белка iRFP на основе бактериофитохрома в качестве акцептора для ферстеровского резонансного переноса энергии (Forster resonance energy transfer, FRET). В качестве доноров энергии использовали GFP-подобные дальнекрасные флуоресцентные белки mKate2, eqFP650 и eqFP670. С целью тестирования FRET создали генно-инженерные конструкции для экспрессии в бактериях, кодирующие донорный и акцепторный белки, соединенные гептадекапептидным линкером. Эффективность FRET оценивали in vitro на выделенных белках по росту эмиссии донора после разрезания линкера. Из трех тестированных конструкций наиболее эффективный перенос энергии (приблизительно 30%) показала пара eqFP650-iRFP.

НЕШКОВА А.Е., ЯРОВАЯ Г.А. — 2015 г.

Многокомпонентность калликреин-кининовой системы (ККС), полифункциональность системы в целом и каждого из ее компонентов, обеспечивающих ее участие в процессах адаптации, защиты организма и во многих других физиологических и патологических состояниях, является основной причиной неослабевающего интереса к этой системе в течение уже почти целого столетия. Обзор посвящен основным этапам расширения поля изучения ККС – от первых наблюдений гипотензивного эффекта мочи человека, введенной экспериментальным животным, до последних открытий, позволяющих понять структуру компонентов системы, осуществить клонирование и картирование генов этих компонентов. Представлены данные о свойствах и структуре индивидуальных компонентов системы и их пострансляционных превращениях. Существенное внимание уделено активации ККС в плазме крови, поскольку генерализованный кининогенез инициируется именно активацией прекалликреина плазмы. Приведены новые сведения о тканевой ККС, в том числе о тканевых калликреинах, гены которых расположены в дистальном отделе длинного плеча 19-й хромосомы. Многие из этих калликреинов рассматриваются в настоящее время как маркeры гормонозависимых злокачественных опухолей.

АМИРХАНОВ Н.В., АМИРХАНОВ Р.Н., ЗАРЫТОВА В.Ф., МАЗУРКОВА Н.А. — 2015 г.

На культуре клеток MDCK, инфицированных вирусом гриппа A человека (подтип H3N2), исследована противовирусная активность нанобиокомпозитов TiO2·PL·ДНК/ПНК, в которых ПНК-фрагмент в виде ДНК/ПНК-гетеродуплекса связан электростатически с полилизином, предварительно иммобилизованным на наночастицах диоксида титана (TiO2·PL). Показано, что TiO2·PL ·ДНК1/ПНК1-нанобиокомпозит, несущий фрагмент ПНК1, направленный к 3-концу некодирующей области сегмента 5 вирусной РНК (вРНК), специфично и эффективно подавляет репродукцию вируса на 99.8%. Определено, что для нанокомпозита TiO2·PL·ДНК1/ПНК1 50%-ная цитотоксическая концентрация (TC50) составляет более 1200 мкг/мл, а 50%-ная эффективная ингибирующая концентрации (IC50) составляет менее 3 мкг/мл. Таким образом, нанобиокомпозиты TiO2·PL·ДНК/ПНК не только способны проникать через клеточные мембраны, но и проявляют высокую специфическую антисенс-активность, не вызывая при этом токсического воздействия на живые клетки.

ВАСИЛЬЕВ В.Г., МОРОЗОВА E.А., САЛАХУТДИНОВ Н.Ф., СОКОЛОВА А.С., ТОЛСТИКОВА Т.Г., ЯРОВАЯ О.И. — 2015 г.

Описан синтез симметричных производных камфоры, содержащих в своем остове два четвертичных атома азота, и результаты исследования их миорелаксантной активности на мышах. В качестве сравнения описан синтез и проведено исследование активности солей на основе мета- и пара-замещенных ксилилендибромидов.

ВАСИЛЬЕВ Н.В., ЗАТОНСКИЙ Г.В., ИВАНОВСКАЯ Н.П., КОСТРЮКОВА Т.С., ОСИН Н.С. — 2015 г.

С целью разработки новых маркеров для иммунофлуоресцентного анализа с временным разрешением люминесценции получен тетракетодиэфир ряда карбазола, содержащий метоксикарбонильные реакционноспособные группы, отделенные от хелатирующего 1,3-дикарбонильного фрагмента дифторметиленовыми спейсерами (CF2)4. Комплексы этого соединения с ионами Eu3+ устойчивы в водных растворах и обладают интенсивной длительно живущей ( 550–570 мкс) люминесценцией с основными максимумами: эмиссии – в области 615 нм и возбуждения – в области 380–390 нм, что отличает их от большинства применяемых аналогов. Получен конъюгат этого соединения со стрептавидином, люминесцентно-спектральные характеристики которого позволяют использовать его в качестве универсального реагента для различных схем биологического микроанализа.

БОЙКО А.А., КОВАЛЕНКО Е.И., МИРЗОЕВ Р.Р., ПЕРЦЕВА М.А., САПОЖНИКОВ А.М., ТРОЯНОВА Н.И., ШЕВЧЕНКО М.А. — 2015 г.

Активные формы кислорода (АФК), продуцируемые фагоцитирующими клетками системы врожденного иммунитета, играют важную роль в первой линии защиты организма от болезнетворных микроорганизмов. Основным источником АФК у всех разновидностей фагоцитирующих клеток является мембраноассоциированный мультимолекулярный комплекс NADPH-оксидазы (КФ 1.6.3.1). Процесс формирования этого комплекса и его активность зависят от многих факторов, способных как усиливать, так и подавлять интенсивность генерации АФК. Вместе с тем, в последние годы появляется все больше свидетельств о существовании малоизученных механизмов ограничения продукции АФК фагоцитами, направленных на защиту собственных тканей от повреждающего действия кислородных радикалов в очагах воспаления. Наши предыдущие данные и результаты работ других авторов указывают на то, что одно из звеньев этой системы ограничения может быть связано с иммуномодулирующей активностью внеклеточного пула белков теплового шока 70 кДа (БТШ70). В настоящей работе использован ряд клеточных моделей с применением ингибиторов NADРН-оксидазы для анализа возможной связи механизмов супрессирующего действия БТШ70 на продукцию АФК фагоцитами и взаимодействия БТШ70 с субъединицами данного ферментного комплекса. Полученные результаты подтвердили литературные сведения о способности экзогенных БТШ70 модулировать активность NADРН-оксидазы и впервые продемонстрировали ингибирующее действие этих протеинов на интенсивность генерации АФК во внутриклеточном пространстве фагоцитов.

БАЛАЛАЕВА И.В., ДЕЕВ С.М., ЗДОБНОВА Т.А., СОКОЛОВА Е.А. — 2015 г.

Продемонстрирована направленная доставка полупроводниковых квантовых точек (КТ) в организме иммунодефицитных лабораторных животных к экспериментальной опухоли молочной железы человека, гиперэкспрессирующей онкомаркер HER2. Для получения направленных комплексов КТ использована пара адаптерных белков, рибонкулеаза барназа и ее ингибитор барстар. Специфическое связывание с онкомаркером-мишенью обеспечено за счет бивалентного рекомбинантного белка, содержащего пептидные последовательности двух молекул одноцепочечного вариабельного фрагмента анти-HER2 антитела 4D5 (4D5scFv) и одной молекулы барназы. КТ конъюгировали с барстаром, итоговая сборка направленных комплексов осуществлялась за счет нековалентного специфического взаимодействия барстара в составе конъюгатов с КТ и барназы в составе направляющего рекомбинантного белка. Показанная нами доставка КТ к опухоли, экспрессирующей HER2, демонстрирует возможности и перспективы описанного подхода для направленной доставки наночастиц к опухолевым клеткам in vivo с целью повышения эффективности диагностики, а также развития основанных на использовании наночастиц методов терапии.

АЛИЕВ Т.К., ДОЛГИХ Д.А., КИРПИЧНИКОВ М.П., КОРОБОВА С.В., ЛАРИНА М.В., ПОЗДНЯКОВА Л.П., СВЕШНИКОВ П.Г., СОЛОПОВА О.Н., ЯКИМОВ С.А. — 2015 г.

Аутоиммунные заболевания – это хронические заболевания, при которых иммунный ответ направлен на собственные антигены организма, что приводит к повреждению тканей и нарушению их нормального функционирования. Нередко эти заболевания приводят к инвалидности и смерти пациентов. На сегодняшний день для направленной терапии аутоиммунных заболеваний успешно применяется ряд моноклональных антител к провоспалительным цитокинам и их рецепторам. Одной из перспективных мишеней для лечения аутоиммунных заболеваний является интерферон- ( ), цитокин, играющий ключевую роль в дифференцировке Th1-клеток, активации макрофагов и воспалении. В работе был получен набор из 5 моноклональных антител (мАТ) к IFN- человека. Для получения прототипа терапевтического препарата исследованы аффинность полученных антител к IFN- и их способность к блокированию индуцированной IFN- активности. На основании полученных данных для химеризации было выбрано мАТ F1, комплекс которого с IFN- характеризуется константой диссоциации 1.7 нМ; кроме того, это антитело проявило низкое значение IC90 (8.9 ± 2.0 нМ) при ингибировании индуцируемой IFN- экспрессии антигена HLA-DR на поверхности клеток линии U937. Был сконструирован бицистронный вектор для продукции Fab-фрагмента химерного антитела F1 chim в клетках E. coli. Полученный рекомбинантный Fab-фрагмент химерного антитела F1 нейтрализует IFN- -индуцируемую активность in vitro и его комплекс с IFN- характеризуется константой диссоциации 1.8 нМ.

БАРАНОВ М.С., КОВАЛЬЧУК С.Н., КОЖЕМЯКО В.Б., ЛУКЬЯНОВ К.А., ПОВАРОВА Н.В., СЕМИЛЕТОВА И.В. — 2015 г.

Предложено использование тетракис(2-гидроксиэтил)ортосиликата (THEOS) в качестве субстрата для силикатеинов – семейства ферментов, играющих ключевую роль в формировании скелета губок. Проведено сравнение THEOS и широко применяемого в настоящее время субстрата силикатеинов – тетраэтоксиортосиликата (TEOS) в реакции образования аморфного кремнезема in vitro силикатеином А1 губки Latrunculia oparinae. Показано, что реакция с THEOS протекает значительно эффективнее, чем с TEOS, вероятно, благодаря высокой растворимости в воде и более высокой скорости гидролиза THEOS.

АФАНАСЬЕВА Г.В., БЕЛЕЦКИЙ И.П., ГЛУХОВ А.С., ГЛУХОВА К.А., ЗАРИПОВ М.М., ПРУСАКОВА О.В., ТРИЗНА Ю.А. — 2015 г.

Разработан простой и быстрый метод получения меченых моноклональных антител (мкАТ) из культуральной жидкости гибридом в количествах, достаточных для подбора пар антител в сэндвич-варианте иммуноферментного анализа (ИФА) и определения их аффинности. Метод основан на предложенном впервые подходе, который заключается в аффинном связывании мкАТ из культуральной жидкости гибридом с молекулами антигена, сорбированными в 8-луночном планшете, и последующем кратковременном мечении образованных комплексов биотином. На примере мкАТ к рекомбинантному белку вируса осповакцины A27L показано, что количества меченных таким образом антител в лунке достаточно для проверки 25 потенциальных партнеров в сэндвич-варианте ИФА. Метод позволяет экономично и эффективно осуществлять подбор пар мкАТ, не имея больших количеств культуральной или асцитной жидкости и без проведения процедур выделения антител.

БЕЛИНСКАЯ Д.А., ГОНЧАРОВ Н.В., РАЗЫГРАЕВ А.В., УКОЛОВ А.И. — 2015 г.

Молекула альбумина, в отличие от молекул многих других плазменных белков, не покрыта углеводной оболочкой и играет важнейшую роль в поддержании коллоидно-осмотического давления крови, может связывать и транспортировать различные молекулы эндогенного и экзогенного происхождения. В обзоре представлены примеры ферментативной активности альбумина, существование которой большинством исследователей пока еще воспринимается скептически; рассматривается история вопроса, при этом особое внимание уделено эстеразной активности альбумина. Приведены кинетические и термодинамические характеристики взаимодействия альбумина с некоторыми субстратами, рассмотрена возможность отнесения альбумина к определенным классам и номенклатуре ферментов.

НАВОЛОЦКАЯ Е.В. — 2015 г.

Проанализированы и систематизированы данные о свойствах и механизме действия пептида октарфина (TPLVTLFK, фрагмент 12 19 ?-эндорфина) – селективного агониста неопиоидного (не чувствительного к опиоидному антагонисту налоксону) рецептора ?-эндорфина, обнаруженного на клетках иммунной (перитонеальные макрофаги, T- и B-лимфоциты селезенки и крови), эндокринной (кора надпочечников, гипофиз), сердечно-сосудистой (кардиомиоциты) систем. Связываясь с рецептором, октарфин увеличивает индуцированную митогеном пролиферацию T- и B-лимфоцитов человека и мыши in vitro, активирует перитонеальные макрофаги мыши in vitro и in vivo, стимулирует рост человеческих T-лимфобластных клеточных линий Jurkat и MT-4, ингибирует активность аденилатциклазы мембран коры надпочечников крысы и подавляет секрецию глюкокортикоидов из надпочечников в кровь. В диапазоне концентраций 1–1000 нМ пептид увеличивает активность индуцибельной NO-синтазы (iNOS), а также содержание NO и cGMP в активированных липополисахаридом перитонеальных макрофагах мыши. Учитывая, что NO действует как первичный активатор растворимой гуанилатциклазы (sGC), можно предположить, что активирующий эффект октарфина на макрофаги реализуется следующим путем: увеличение экспрессии iNOS возрастание продукции NO увеличение активности sGC возрастание внутриклеточного уровня cGMP.

АКИМОВ М.Г., БЕЗУГЛОВ В.В., ФОМИНА-АГЕЕВА Е.В. — 2015 г.

Оптимизирована процедура определения оксида азота в виде нитрит-иона, пригодная для количественного анализа его продуцирования культурой клеток млекопитающих. Установлено, что оптимальные результаты дает метод Гриса, адаптированный для микрообъемов, после предварительной процедуры восстановления NO , образовавшегося в среде анализа из нитрит-иона, до определяемого NO с помощью неактивированного кадмия. Метод верифицирован на культуре клеток крысиной глиомы С6. Разработанный метод пригоден для определения оксида азота в 96- и 48-луночных культуральных планшетах; предел детектирования составляет 2.1 ± 0.1 мкМ для NO и 2.9 ± 0.1 мкМ для NO .

БЕЛОУСОВ В.В., БИЛАН Д.С., ЛУКЬЯНОВ С.А., ШОХИНА А.Г. — 2015 г.

Большая часть живых клеток поддерживает непрерывный поток электронов, обеспечивая себя энергией. Многие соединения представлены в клетке одновременно в окисленном и восстановленном состояниях, формируя таким образом активные редокс-пары. Некоторые из редокс-пар, например, NAD+/NADH, NADP+/NADPH, окисленный/восстановленный глутатион (GSSG/GSH) – универсальны, поскольку они одновременно участвуют в регуляции многих клеточных реакций. Соотношения окисленной и восстановленной форм этих соединений являются важными клеточными редокс-показателями. Современные подходы исследований позволяют устанавливать новые функции основных редокс-пар в сложной организации клеточных процессов. В обзоре представлена информация об основных редокс-парах клетки, рассмотрено их участие в различных биологических процессах.