научный журнал по биологии Молекулярная биология ISSN: 0026-8984

HE Q.-H., MENG X.-Y., TAN W.-R., YANG M., ZHANG Q.-L., ZHANG S.-Z., ZHAO Y.-Y. — 2014 г.

Лактатдегидрогеназа С4 (LDH-C4) считается перспективной мишенью для разработки контрацептивных средств. С целью получения родентицида, действие которого направлено на подавление размножения черногубой пищухи (Ochotona curzoniae), клонировали ген LDH-C и экспрессировали его в клетках Escherichia coli. Очистили и охарактеризовали рекомбинантный белок. кДНК гена LDH-C пищухи клонировали методом RACE. кДНК размером 1488 п.н. содержит открытую рамку считывания (ORF) из 996 п.н., которая кодирует полипептид из 332 аминокислотных остатков. ORF LDH-C пищухи, не содержащую дополнительных тэгов (меток), ввели в клетки E. coli и экспрессировали в них. Рекомбинантный белок LDH-C4 очистили путем нагревания, аффинной и ионообменной хроматографии. Рекомбинантная LDH-C4 пищухи – это тетрамер с молекулярной массой 140 кДа, стабильный при температуре до 60°C и обладающий температурозависимой каталитической активностью. Оптимум рН прямой и обратной реакции – 7.48 и 10.28 соответственно. Кажущаяся константа Михаэлиса для пирувата и лактата равна 51.2 ± 3.8 и 8568.8 ± 409 мкМ соответственно. Константа ингибирования для щавелевой кислоты – 11.8 ± 3.5 мМ. В представленной работе созданы прочные основы для получения контрацептивного родентицида, действие которого направлено на LDH-C4 пищухи.

ТИЩЕНКО В.М. — 2014 г.

Миеломные иммуноглобулины человека второго подкласса LOM и SIN, а также их Fc- и впервые полученные hFc-фрагменты, у которых присутствует не только “нижний” участок шарнирной области, но и его “сердцевина” (Cys-Cys-Val-Glu-Cys-Pro-Pro-Cys), изучены с помощью ряда физических методов (сканирующая калориметрия, флуоресцентная спектроскопия, аналитическое центрифугирование). Совместный анализ калориметрических и оптических кривых плавления позволил установить, что единственный низкотемпературный пик теплопоглощения на всех кривых плавления соответствует плавлению двух СH2 доменов. Показано, что в составе интактного IgG2 по сравнению с hFc- и Fc-фрагментами СH2-домены дестабилизированы.

ТИЩЕНКО В.М. — 2014 г.

Термодинамические параметры стабилизации нативной структуры СH2-доменов миеломных иммуноглобулинов человека второго подкласса LOM и SIN и впервые полученных hFc-фрагментов этих белков определены с использованием метода сканирующей микрокалориметрии. Показано, что уменьшение термостабильности и энергии стабилизации нативной структуры этих доменов в интактных белках в ”физиологическом” интервале температур (20–37°С) связано, в основном, с энтропийным фактором.

АЛЕКСАНДРОВА А.Ю., ЧИКИНА А.С. — 2014 г.

Все больше данных, получаемых на стыке биохимии, молекулярной и клеточной биологии и экспериментальной онкологии, говорят о том, что образование вторичных очагов опухолевого роста при развитии злокачественных заболеваний (метастазирование) – процесс регулируемый и далеко не случайный. Этот процесс включает, с одной стороны, формирование метастатической популяции клеток, обладающих специальными свойствами, которые облегчают миграцию в отдаленные органы и их заселение, и формирование специфического микроокружения в органе-мишени, с другой. В число изменений клеток входит приобретение ими пластичности миграционных механизмов – способности изменять характер движения на более эффективный в зависимости от микроокружения; появление на поверхности клеток специфических рецепторов, обеспечивающих направленную миграцию к органам-мишеням; появление у них свойств стволовых клеток, позволяющих выживать и размножаться на новом месте. Эти изменения теснейшим образом скоординированы с подготовкой специального микрооружения в органе-мишени, стимулирующего инициацию и рост метастазов – преметастатической ниши. В представленном обзоре проанализированы опубликованные за последние годы данные, посвященные механизмам образования метастатической популяции опухолевых клеток, формирования преметастатических ниш в органах-мишенях и координации этих процессов.

БЕРЕСТЕНЬ С.Ф., КАРПОВ В.Л., ЛИСИЦЫН Н.А., НИКИТИНА И.Г., ЧЁРНЫЙ А.А. — 2014 г.

В обзоре описаны современные методы иммуноанализа белков: радиоиммуноанализ, иммуноферментный анализ, иммуно-ПЦР, электрохимический анализ и метод коиммунопреципитации хроматина, а также основные области их применения.

ГРЕБНЕВА Е.А. — 2014 г.

В настоящее время не вполне ясен механизм образования мутаций сдвига рамки считывания, вызванных циклобутановыми пиримидиновыми димерами. Механизмы образования различных мутаций обычно рассматривают в рамках полимеразной модели мутагенеза. Здесь развивается альтернативная, полимеразно-таутомерная, модель ультрафиолетового мутагенеза. Впервые предлагается механизм образования мишенных инсерций, вызванных цис-син циклобутановыми тиминовыми димерами. Мишенные инсерции – это мутации типа сдвига рамки, обусловленные встраиванием одного или нескольких нуклеотидов в молекулу ДНК напротив повреждений, способных останавливать синтез ДНК. Мишенные инсерции могут быть вызваны, например, циклобутановыми пиримидиновыми димерами. Ультрафиолетовое облучение может приводить к изменению таутомерных состояний оснований ДНК. Так, для основания тимин может образовываться пять редких таутомерных форм, которые стабильны, если соответствующие нуклеотиды входят в состав циклобутановых димеров. Структурный анализ встраивания оснований показал, что напротив одной редкой таутомерной формы тимина невозможно встроить ни одно из канонических оснований так, чтобы между ними образовались водородные связи. Вот почему при SOS- или склонном к ошибкам синтезе ДНК, содержащей цис-син циклобутановые тиминовые димеры с основанием в такой редкой таутомерной форме, специализированные или модифицированные ДНК-полимеразы в соответствующем участке синтезируемой ими цепи оставляют бреши в один нуклеотид. На участках ДНК с однородным нуклеотидным составом, в соответствии с моделью Стрейзингера, конец растущей нити ДНК может сползти, образовать комплементарные пары с близлежащей областью матричной цепи, приняв при этом форму петли. В результате дочерняя нить удлиняется и появляется мишенная инсерция. Впервые показано, что к мишенным инсерциям приводят такие цис-син циклобутановые тиминовые димеры, одно или оба основания в которых находится в определенной таутомерной форме, напротив которой невозможно встроить ни одно из канонических оснований, чтобы между ними образовались водородные связи. Кроме того, разработана модель образования мишенных вставок из одного или нескольких оснований, вызванных цис-син циклобутановыми тиминовыми димерами. Следовательно, полимеразно-таутомерная модель ультрафиолетового мутагенеза способна объяснить природу и механизмы образования не только горячих и холодных пятен, мишенных и немишенных мутаций замены оснований, но и мишенных мутаций сдвига рамки.

КИСЕЛЕВ Ф.Л. — 2014 г.

Обзор посвящен анализу данных о роли микроРНК в прогресcии опухолей человека. Подробно рассмотрены следующие вопросы: общая характеристика микроРНК, паттерн их экспрессии в опухолях человека и специфичность этой экспрессии, возможная роль микроРНК как онкогенов и супрессоров опухолевого роста, участие микроРНК в процессах, обусловливающих трансформированный фенотип опухолевых клеток, значение микроРНК для ранней диагностики и прогноза заболевания.

ГВОЗДЕВ В.А., КОГАН Г.Л. — 2014 г.

Обзор посвящен рассмотрению функций комплекса NAC (nascent polypeptide-associated complex) и его отдельных субъединиц. NAC – это консервативный гетеродимерный белок, обнаруживаемый в геномах всех эукариот, от дрожжей до человека. NAC cостоит из - и -субъединиц, димеризующихся благодаря взаимодействию NAC-доменов, обратимо связывается с рибосомой и контактирует с новосинтезированным полипептидом, защищая его от протеолиза и способствуя укладке полипепидной цепи. Мутации и делеции генов, кодирующих субъединицы NAC, летальны на ранних стадиях развития многоклеточных эукариот. NAC участвует в сборке и транспорте de novo синтезированных белков и в биогенезе рибосом. Димер -субъединиц NAC cвязывает РНК и ДНК, выполняет функции фактора транскрипции. -Субъединица взаимодействует с каспазой-3, участвуя в регуляции апоптоза. Гетеродимерные варианты NAC можно рассматривать как шапероны, вовлеченные в ответ клетки и организма на стрессовые воздействия, а также как регуляторы апоптоза. Гены, кодирующие -субъединицу NAC, быстро эволюционируют. В процессе эволюции возможны дупликации этих генов, которые характеризуются тканеспецифичной экспрессией и кодируют -субъединицы с разным числом повторяющихся аминокислотных последовательностей – вероятных сайтов разрезания каспазой-3. NAC – яркий пример белка (moonlighting protein), выполняющего многообразные биологические функции.

КАЙГОРОДОВА И.А., МАНДЗЯК Н.Б. — 2014 г.

Молекулярно-филогенетический анализ на основе сравнения фрагментов гена первой субъединицы митохондриальной цитохром-c-оксидазы (COI) сибирских глоссифоний и филогенетически близких им палеарктических видов показал, что сибирские глоссифонии не относятся к виду Glossiphonia complanata, как считалось ранее, а имеют независимый таксономический статус. Кроме того, выявленный уровень генетических отличий позволяет признать исследуемый фрагмент mtCOI пригодным маркером для молекулярной идентификации пиявок семейства Glossiphoniidae (Hirudinea).

CHOJDASH B., DAMDINSUREN N., БЕЛЫХ О.И., БУТИНА Т.В., МУХАНОВ В.С., ПОТАПОВ С.А., РЫЛЬКОВА О.А. — 2014 г.

Исследовано разнообразие цианомиовирусов семейства Myoviridae, обитающих в оз. Хубсугул, на основе анализа фрагментов гена g20. Показано, что последовательности этого гена цианомиовирусов разнообразны и сходны с соответствующими генами вирусов из оз. Байкал. Наличие близкородственных штаммов вирусов в этих водоемах определяется их географической близостью, прямой водной связью, а также сходством гидрохимических параметров этих озер.

HAN C.-X., LI H., SUI D.-D., WU J.-L., ZHANG D.-H., ZHANG H., ZHOU Z.-M. — 2014 г.

Белок zona pellucidа 3 (ZP3) играет ключевую роль в иммунности репродуктивной системы. Используя быструю амплификацию концов кДНК с последующей полимеразной цепной реакцией (RACE-PCR) получили полную кДНК, кодирующую ZP3 китайского цокора Myospalax fontanierii. Эта кДНК содержит открытую рамку считывания из 1269 н., кодирующую полипептид из 422 аминокислотных остатков, высокогомологичный ZP3 хомячка (78%), мыши (76%) и крысы (74%). XhoI–SacI-фрагмент кДНК ZP3 размером 1158 п.н., не кодирующий сигнальный пептид и домен, сходный с трансмембранным, клонировали под контроль промотора фага Т7-lac-оператора в вектор рЕТ-28а(+). Рекомбинантный белок рЕТ-ZokorZP3 (r-ZP3) экспрессировали в штамме BL21(DE3) Escherichia coli в виде слитого с полигистидином белка. Оптимум экспрессии наблюдали через 2 ч после индукции 1 мМ IPTG при 28°C. Очищенный белок анализировали с помощью вестерн-блотинга.

ЕМЕЛЬЯНОВ А.К., ПЧЕЛИНА С.Н., УСЕНКО Т.С. — 2014 г.

Болезнь Паркинсона – широко распространенное нейродегенеративное заболевание, симптомы которого коррелируют с гибелью дофаминергических нейронов черной субстанции головного мозга. В патогенез болезни Паркинсона вовлечены такие факторы, как агрегация белка -синуклеина, окислительный стресс, дисфункция митохондрий и активация апоптоза, однако точный молекулярный механизм нейродегенерации остается неизвестным. Болезнь Паркинсона носит преимущественно спорадический характер. Между тем, за последние 15 лет выявлены и описаны редкие моногенные формы этого заболевания. При семейных формах болезни Паркинсона наиболее часто обнаруживают мутации в гене LRRK2, кодирующем протеинкиназу 2, обогащенную лейциновыми повторами, однако механизм возникновения заболевания у носителей мутаций в этом гене не установлен. Изучение сигнальных каскадов, регулируемых этой киназой, существенно затрудняется отсутствием знаний о физиологических субстратах LRRK2. Наличие основной мутации в гене LRRK2 – G2019S – значительно облегчает выявление больных с LRRK2-ассоциированной формой болезни Паркинсона в различных популяциях. В представленном обзоре обсуждаются данные о влиянии мутаций в гене LRRK2 на формирование белковых агрегатов, в частности агрегатов -синуклеина, динамику цитоскелета, развитие воспаления и индукцию апоптоза, полученные как в опытах in vitro, так и при обследовании больных. Изучение редких наследственных форм болезни Паркинсона с известной этиологией способствует пониманию механизмов нейродегенерации при более распространенных спорадических формах этого заболевания.

МАРТЫНЕНКО Н.Н., НАУМОВ Г.И., НАУМОВА Е.С., САДЫКОВА А.Ж. — 2014 г.

Для изучения молекулярного полиморфизма генов SUC, кодирующих -фруктозидазу (инвертазу) у дрожжей рода Saccharomyces, сравнивали нуклеотидные последовательности субтеломерных генов SUC3, SUC5, SUC7, SUC8, SUC9, SUC10 дрожжей S. cerevisiae и гена SUCa дрожжей S. arboricola, а также некоторых опубликованных ранее нуклеотидных последовательностей других генов SUC. Анализ спектра нуклеотидных замен показал, что преобладают молчащие транзиции C T, более 80% которых расположено в третьем положении кодона. Выведенные на основании этих последовательностей аминокислотые последовательности -фруктозидаз сходны на 88–100%. Наиболее дивергированы белки SUCa (S. arboricola) и SUCb (S. bayanus), уровень сходства которых с остальными белками SUC не превышает 92%. Виды S. arboricola, S. bayanus, S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae и S. paradoxus имеют только по одной копии гена SUC и не накапливают полимерные гены, как это характерно для штаммов S. cerevisiae из промышленных популяций. По-видимому, субтеломерные повторы -фруктозидазных генов SUC появились в геноме дрожжей S. cerevisiae под воздействием селекционного отбора в процессе их доместикации.

ВОЕВОДА М.И., ВОРОПАЕВА Е.Н., МАКСИМОВ В.Н., ПОСПЕЛОВА Т.И. — 2014 г.

Ассоциация полиморфных участков rs1042522, rs17878362 и rs1625895 гена ТР53 с риском развития неходжкинских лимфом изучена недостаточно. Разнообразие вариантов заболевания, а также малый эффект каждого из полиморфизмов требуют анализа данных маркеров при отдельных гистологических подтипах лимфом и в составе групп гаплотипов. Цель настоящего исследования - анализ частот rs1042522, rs1625895 и rs17878362, их тройного гаплотипа и неравновесия по сцеплению у больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой и в контрольной группе. Выявлены отличия в структуре неравновесия по сцеплению (LD) между маркерами rs17878362, rs1042522 и rs1625895 гена ТР53 в популяции Сибирского региона. Установлена большая информативность гаплотипического подхода при анализе методом случай-контроль ассоциаций полиморфизмов гена ТР53 с риском развития диффузной В-крупноклеточной лимфомы, чем изучение отдельных полиморфизмов. Обнаружена ассоциация гаплотипа wArgG с предрасположенностью к диффузной В-крупноклеточной лимфоме и протективный эффект гаплотипов wProG или dupProG. Отмечено различие в эффектах тройного гаплотипа гена ТР53 в зависимости от гомозиготного или гетерозиготного состояния.

БЕЛОВА Е.В., ДОНЦОВА О.А., ЕВФРАТОВ С.А., ЖИРОНКИНА О.А., ЗВЕРЕВА М.Э., КИРЕЕВ И.И., ОЛОВНИКОВ А.М., РУБЦОВА М.П., СКВОРЦОВ Д.А., СТРЕЛКОВА О.C., ЧЕРЕПАНИНЕЦ В.Д., ШУБЕРНЕЦКАЯ О.С. — 2014 г.

Некодирующие и повторяющиеся нуклеотидные последовательности составляют значительную часть генома высших эукариот, однако изучение их функциональной значимости и механизмов действия только начинается. Нами показано, что в геноме Danio rerio внутренние теломерные повторы локализуются вместе с другими повторяющимися элементами, а именно с hAT и EnSpm, широко представленными в геномах позвоночных. Рассмотрение участка генома, содержащего две близкорасположенные пары таких повторов, показало, что эта область транскрипционно активна. В ядрах фибробластов D. rerio выявлены РНК-зависимые структуры, содержащие данную последовательность, что может указывать на функциональную значимость повторяющихся элементов генома или их транскриптов.

БЕРЕСТЕНЬ С.Ф., ГРИНЕВА Е.Н., КАРПОВ В.Л., ЛИСИЦЫН Н.А., НИКИТИНА И.Г., САБИРОВА Е.Ю., СОЛОПОВА О.Н., СУРЖИКОВ С.А. — 2014 г.

Описан новый формат иммуно-ПЦР, основанный на детекции мембранного белка CDH17 в составе сывороточных экзосом. Использование формата позволяет различить образцы сыворотки крови здоровых доноров и больных раком толстой кишки. Полученные результаты открывают возможность сывороточной диагностики рака толстой кишки в группах повышенного риска.

ИВАНОВ А.В., КАРПОВА Г.Г., МАЛЫГИН А.А. — 2014 г.

Известно, что рибосомный белок (rp) S26e человека способен связываться с первым интроном своей пре-мРНК и тем самым ингибировать ее сплайсинг. В настоящей работе с помощью гидроксил-радикального футпринтинга проведено детальное картирование участка связывания rpS26e на РНК-транскрипте, соответствующем фрагменту его пре-мРНК, который содержит первый интрон, фланкированный первым экзоном и частью второго экзона. Определены нуклеотиды РНК, защищаемые от атаки гидроксил-радикалами в присутствии rpS26e. Большинство из них обнаружено в районе 3-сайта сплайсинга первого интрона в пурин-богатой последовательности, которая в рассчитанной вторичной структуре пре-мРНК rpS26e образует петлю, соединяющую две спирали, а остальные нуклеотиды расположены вблизи 5-сайта сплайсинга. При сравнении участков связывания rpS26e на вторичных структурах пре-мРНК и 18S рРНК выявлены элементы сходства в организации этих участков. Оказалось, что оба участка содержат структурный мотив, представленный протяженной пурин-богатой петлей между двумя спиралями, который мог бы узнавать rpS26e при связывании с этими РНК. Полученные данные проливают свет на структурные аспекты РНК-белковых взаимодействий, лежащих в основе авторегуляции экспрессии гена RPS26 человека на уровне сплайсинга.

LIN HUA, PING ZHOU — 2014 г.

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) – это сложное заболевание человека с высокой летальностью. До сих пор работы по ХОБЛ не были достаточно охарактеризованы, несмотря на хорошо документированную роль курения в развитии ХОБЛ. В последние годы использование анализа экспрессионных микрочипов позволяет идентифицировать различные гены, вероятно относящиеся к тем или иным заболеваниям. Однако низкая воспроизводимость выявляемых генов, представленных в публикациях, не выдерживает критики. Исходя из этого, мы предположили, что использование информации о клеточных путях и сетях взаимодействий при выявлении прогностических биомаркеров способно улучшить эффективность их предсказания. Скомбинировав информацию о белок-белковых взаимодействиях (protein-protein interactions, PPI) с методом опорных векторов (support vector machine, SVM), мы попытались идентифицировать потенциальные гены, имеющие отношение к ХОБЛ. Такой подход позволит достоверно различать тяжелую эмфизему и средне- или неэмфизематозные ткани легких. В результате идентифицировано 8 генов, функционально связанных с ХОБЛ. По сравнению с другим вариантом метода SVM, в котором не используются данные по PPI, предсказательная точность разработанного нами комбинированного метода значительно выше (AUC увеличивается с 0.513 до 0.909). Полученный результат подтверждает предположение, что использование данных о сетях взаимодействий в методах селекции генов может существенно повысить точность классификации. Таким образом, показано, что из профилей экспрессии генов эмфизематозных легочных тканей человека можно извлечь сведения о патогенезе ХОБЛ, а хорошо систематизирующий алгоритм предсказания, основанный на предварительно известной биологической информации, еще больше повышает качество классификации.

ГРОМЫКО О.Е., ЕМЕЛЬЯНОВА М.А., ЗАСЕДАТЕЛЕВ А.С., ИГНАТОВА Е.О., КАЗУБСКАЯ Т.П., ЛЮБЧЕНКО Л.Н., НАСЕДКИНА Т.В., ПОРТНОЙ С.М. — 2014 г.

Выявление герминальных мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2 составляет основу молекулярной диагностики предрасположенности женщин к раку молочной железы и яичников. Нами разработана методика быстрого генотипирования мутаций в гене BRCA1 (185delAG, 300T>G, 4153delA, 4158 A>G, 5382insC), гене BRCA2 (695 insC, 6174delT) и гене CHEK2 (1100delC) с использованием биочипов. Протестировано 412 больных РМЖ, из случайной выборки (без учета семейной истории) по Центральной России. У 25 (6.0%) из них рак молочной железы диагностирован в составе первично-множественных злокачественных новообразований (рак яичников, колоректальный рак, рак шейки матки и т.д.). Мутации BRCA1/2 и CHEK2 определены у 33 (8.0%) больных РМЖ. Наиболее часто встречаются мутации 5382insC в гене BRCA1 (3.9% от общего числа пациенток) и 1100delC в гене CHEK2 (1.7% соответственно). Предлагаемый метод эффективен при обнаружении наиболее распространенных в Центральной России герминальных мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2 , что позволяет использовать его в качестве высокопроизводительного диагностического инструмента в клинической онкологической практике.

FURUKAWA M., KINOSHITA K., SAKURAI A., TANJOH K., YAMAGUCHI J. — 2014 г.

Тепловой удар считается одним из факторов, приводящих к повреждению эндотелиальных клеток. Цель данной работы – изучение временных профилей продукции цитокинов (IL-6 и IL-8) и их мРНК эндотелиальными клетками, которые подвергли действию повышенных температур. Первую группу эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) культивировали при четырех различных температурах (37, 38, 39 или 40°C) в течение 1 ч, 3 ч и 5 ч. Во второй группе клетки HUVEC культивировали при 37°C в течение 4 ч или 23 ч после предварительного прогревания в течение 1 ч при тех же температурах, что и в первой группе (от 37 до 40°C). После этих процедур измеряли содержание белков IL-6 и IL-8 и соответствующих им мРНК. Выявлено, что в клетках, культивируемых при повышенной температуре (39°C и 40°C), содержание IL-6 и 8 достоверно ниже (p < 0.001), чем в клетках, которые росли при 37°C (в контроле); причем снижение количества белка было температурно-зависимым. Однако через 23 ч после кратковременного гипертермического воздействия (40°C, 1 ч) на клетки содержание IL-6 и IL-8 было достоверно выше, чем в контроле (p < 0.001). Таким образом, после кратковременной гипертермии продукция цитокинов эндотелиальными клетками сначала снижалась, а затем увеличивалась. Во всех группах клеток через 24 ч после теплового воздействия содержание мРНК IL-6 и IL 8 было достоверно выше (p < 0.001), чем в контроле (37°C). На основании полученных результатов можно предполагать, что после прекращения гипертермии повреждение тканей продолжает развиваться – так что есть определенный риск недооценки значимости индуцированного цитокинами повреждения тканей в острой фазе гипертермии.