научный журнал по химии Прикладная биохимия и микробиология ISSN: 0555-1099

Архив научных статейиз журнала «Прикладная биохимия и микробиология»

  • ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕННЫХ ЭПИТОПОВ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS C ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

    БЫВАЛОВ А.А., ДУДИНА Л.Г., ЛИТВИНЕЦ С.Г., НОВИКОВА О.Д., ОВОДОВ Ю.С., ПОРТНЯГИНА О.Ю., ХОМЕНКО В.А. — 2014 г.

    С помощью набора моноклональных антител проведена оценка влияния внешних воздействий на иммунохимическую активность бактерий Yersinia pseudotuberculosis и выделенных из них препаратов липополисахарида. Показано, что полученные гибридомы продуцируют моноклональные антитела к различным и, по-видимому, видоспецифическим эпитопам, ассоциированным с О-боковыми цепями липополисахарида, концентрация которых возрастала с понижением температуры культивирования бактерий. Установлено ингибирующее влияние протеиназы К, пепсина и трипсина на иммунохимическую активность бактериальных клеток, определенную методом твердофазного иммуноферментного анализа. Иммуноферментным методом показано, что на результаты реакции между использованными моноклональными антителами и антигенными препаратами (липополисахаридами и микробными клетками) разнонаправленно влияет обработка перйодатом натрия, что может быть следствием различной локализации эпитопов липополисахарида, выявляемых моноклональными антителами четырех линий.

  • ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ БИОРЕГУЛЯТОРА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС

    БУРЯК А.К., ИЛЬИНА А.П., МОЛЯВКА А.А., ЯМСКОВ И.А., ЯМСКОВА В.П. — 2014 г.

    Из ткани мозга крысы линии Wistar выделен биорегулятор, действующий в сверхмалых дозах. С помощью метода ВЭЖХ в обращенной фазе получен гомогенный полипептид c молекулярной массой 4749 ± 2 Да, который отвечает за проявление биологической активности биорегулятора. Методами КД-спектроскопии рассчитано процентное содержание канонических элементов вторичной структуры полипептида в растворе. Методами протеомных исследований установлено, что структура изученного полипептида идентична N-концевой последовательности фрагмента гуанин-нуклеотидсвязывающего Gо-белка (субъединица -1).

  • КЛЕТОЧНЫЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ПОИСКА МОДУЛЯТОРОВ АКТИВНОСТИ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ

    ВАХИТОВ В.А., ВАХИТОВА Ю.В., ЗАЙНУЛЛИНА Л.Ф., САДОВНИКОВ С.В., САЛИМГАРЕЕВА М.Х., ФАРАФОНТОВА Е.И. — 2014 г.

    На основе репортерных люциферазных конструкций, содержащих сайты связывания транскрипционных факторов CREB, NFAT, NF-кB, p53, STAT1, GAS, VDR, HSF1 и HIF1 , получены тест-системы для мониторинга активности и поиска веществ – активаторов или ингибиторов биомишеней – транскрипционных факторов. Оценку функциональной активности репортерных конструкций проводили путем их транзиентной трансфекции в клетки линии HEK293 с последующей обработкой специфическими индукторами. Показана функциональная активность всех репортерных конструкций, о чем судили по увеличению экспрессии люциферазы. Для доказательства работоспособности предложенных тест-систем использовали аспирин. Показано, что инкубация трансфецированных репортерными конструкциями клеток в присутствии аспирина сопровождается подавлением связывающей активности NF- B, HIF1 , GAS, VDR и HSF. Полученные нами данные в отношении NF- B, NFAT и STAT1 подтверждают литературные сведения о механизмах действия аспирина. Выявленные эффекты препарата на активность HIF1 , GAS, VDR, CREB и HSF показаны впервые.

  • КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО НОВУЮ АМИЛОМАЛЬТАЗУ ИЗ ПОЧВЕННОЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ДНК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИКЛОДЕКСТРИНОВ С БОЛЬШИМ РАЗМЕРОМ ЦИКЛА

    КОЛПИБУН Ж., МУРАКАМИ С., ПОНГСАВАСДИ П., РУДИКАЛТАМРОНГ П., САВАЗДИ К., ЦИММЕРМАНН В. — 2014 г.

    Выделен новый ген амиломальтозы из популяций ДНК в образцах почвы, отобранных в горячем источнике Бан Нонг Хрок в Таиланде, без проведения бактериального культивирования. С помощью ПЦР был получен полноразмерный ген (1.5 т.п.н.), который амплифицировали и лигировали в вектор “pGEM -T easy”. Полученный вектор трансформировали в штамм Escherichia coli DH5 для проведения секвенирования. Полученный ген, кодирующий амиломальтазу, состоял 1503 пар оснований, что соответствовало 500 аминокислотам. Кодируемая этим геном аминокислотная последовательность обладала высокой степенью гомологии с амиломальтазой из Thermus thermophillus АТСС 33923. Для экспрессии фермента клонированный ген субклонировали в плазмиду рЕТ-17b, которую потом трансформировали в штамм Е. coli BL21 (DE3). Максимальная экспрессия белка наблюдалась в экспериментах, когда клонированные клетки выращивали при 37°С в течение 6 ч, после чего культуру индуцировали 0.5 мМ ИПТГ. Определенная при помощи электрофореза в ПААГ с Na-ДДС относительная молекулярная масса выделенной амиломальтазы составила 58 кДа. Выделенный фермент обладал максимальной активностью при 70°C и рН 9.0. Показано, что фермент может гидролизовать крахмал из гороха, с образованием циклодекстринов (CD) с большим размером циклов и степенью полимеризации, равной и выше 23. В полученном продукте наибольшую фракцию составили CD29 во всех проведенных экспериментах.

  • КОМПАРТМЕНТАЦИЯ САЛИЦИЛАТ-ИНДУЦИРУЕМЫХ БЕЛКОВ (ОБЗОР)

    ТАРЧЕВСКИЙ И.А. — 2014 г.

    Ключевой фактор иммунитета – салициловая кислота (экзогенная или быстро накапливающаяся при действии на растения биотрофных и полубиотрофных патогенов) вызывает образование не только защитных белков прямого антипатогенного действия, но и многих белков, повышающих устойчивость клеток растения-хозяина. Кодируемые ядерными генами и затем образующиеся с помощью цитоплазматических рибосом салицилат-индуцируемые белки осуществляют свои функции или в цитозоле, или доставляются в ядра, вакуоли, пластиды, митохондрии, а также за пределы плазмалеммы. В статье приводится информация о салицилат-индуцируемых белках, не только транспортируемых в различные компартменты, но и участвующих в их трансмембранном переносе.

  • КСИЛАНАЗА И ЦЕЛЛЮЛАЗА ГРИБА CERRENA UNICOLOR ВКМ F-3196: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА, ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОСАХАРИВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

    БЕЛОВА О.В., ВИНОКУРОВА Н.Г., КОСТЕНЕВИЧ А.А., ЛЕОНТЬЕВСКИЙ А.А., ЛИСОВ А.В., ЛОБАНОК А.Г., САПУНОВА Л.И. — 2014 г.

    Базидиомицет Cerrena unicolor ВКМ F-3196 в условиях глубинного культивирования в среде, содержащей микрокристаллическую целлюлозу, способен продуцировать ксиланазу и целлюлазу. Методом ионообменной и гидрофобной хроматографии получены препараты целлюлазы и ксиланазы в электрофоретически гомогенном состоянии. Молекулярная масса как целлюлазы, так и ксиланазы была 44 кДа. Показано, что ксиланаза катализировала гидролиз ксилана с образованием ксилозы, ксилобиозы и ксилотетраозы и проявляла свойства эндоксиланазы. Целлюлаза гидролизовала карбоксиметилцеллюлозу, ксилан, микрокристаллическую целлюлозу с образованием целлотриозы и целлотетраозы. Оптимум рН для действия обоих ферментов 4.0. Ферменты обладали умеренной термостабильностью: ксиланаза сохраняла 35% от исходной активности в течение 1 ч при 60°C, целлюлаза – 10% при тех же условиях. Ксиланаза, целлюлаза, а так же их смесь осахаривали растительное сырье: пшеницу, рожь, пшеничные отруби, овес, что указывает на возможное применение этих ферментов в биотехнологии.

  • ЛИПАЗЫ В РЕАКЦИЯХ КАТАЛИЗА В ОРГАНИЧЕСКОМ СИНТЕЗЕ (ОБЗОР)

    БЕЗБОРОДОВ А.М., ЗАГУСТИНА Н.А. — 2014 г.

    В обзоре рассмотрены проблемы ферментативного катализа в реакциях органического синтеза, в которых катализатором является липаза. Кратко изложены данные о современных методах белковой инженерии и модификации ферментов, позволяющие расширить круг используемых субстратов. Показано участие липазы в получении лекарственных и агрохимических препаратов, лишенных неактивных энантиомеров, а так же в синтезе энантиомеров вторичных спиртов и оптически активных амидов. Обсуждается вопрос об участии липазы в формировании С–С связи в реакции Михаэля. Представлены данные о ферментативном синтезе конструкционных материалов – полиэфиров, силоксанов и др. Приведены примеры реализации процесса ферментативного катализа в промышленности с участием липазы.

  • МЕЛАНИНОВЫЕ ПИГМЕНТЫ ГРИБОВ В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ СУЩЕСТВОВАНИЯ (ОБЗОР)

    БЕЛОЗЕРСКАЯ Т.А., ГЕССЛЕР Н.Н., ЕГОРОВА А.С. — 2014 г.

    Обзор посвящен исследованиям функций меланиновых пигментов у грибов. Рассмотрены вопросы участия меланиновых пигментов в защите от действия факторов внешней среды. Приведены данные о путях биосинтеза и типах меланиновых пигментов у грибов.

  • МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ДИНАМИЧЕСКИХ АТОМНО-СИЛОВЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ (ОБЗОР)

    ИВШИНА И.Б., КОРШУНОВА И.О., КУЮКИНА М.С., РУБЦОВА Е.В. — 2014 г.

    Атомно-силовая микроскопия (АСМ) – эффективный метод исследования поверхностной ультраструктуры и наномеханических свойств биологических объектов, в том числе живых микроорганизмов. Важным условием АСМ-сканирования в жидкой среде является правильно подобранный метод иммобилизации микроорганизмов, обеспечивающий прочное закрепление клеток на поверхности биологически инертной подложки и сохранение их нативных свойств. В обзоре приведена сравнительная характеристика методов иммобилизации микроорганизмов, применяемых в динамических АСМ-исследованиях. Рассмотрены техники механического удерживания и химического связывания клеток с подложкой, а также белковая и иммуноспецифическая адсорбция.

  • МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ СЕЛЕКЦИИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ БАКТЕРИОФАГОВ БАКТЕРИЙ РОДОВ PSEUDOMONAS И STAPHYLOCOCCUS

    ДАРБЕЕВА О.С., ИГНАТЬЕВ Г.М., КУЛИКОВ Е.Е., ЛЫСКО К.А., МИРОШНИКОВ К.А. — 2014 г.

    Состав экспериментально подобранных смесей бактериофагов, промышленно выпускаемых НПО “Микроген” для профилактики и лечения стафилококковых и псевдомонадных инфекций, был проверен с помощью просвечивающей электронной микроскопии негативного контрастирования. Результаты биоинформационного анализа геномов известных фагов Pseudomonas и Staphylococcus показали, что основная популяция бактериофагов в смесях принадлежит группам, пригодным для использования в терапевтических целях. Однако поскольку результаты изучения морфологии фаговых частиц не всегда позволяли сделать однозначный вывод о соответствии фага конкретной группе, требуется генотипирование бактериофагов на основе консервативного генетического локуса, которое даст возможность определить их принадлежность к определенной генетической группе.

  • МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫЙ БИОРЕАКТОР НА ОСНОВЕ КОМПЛЕКСА ХИТИНАЗ

    ВЛАХ Е.Г., ПОНОМАРЁВА Е.А., ТЕННИКОВА Т.Б. — 2014 г.

    Получен гетерогенный биокатализатор, содержащий на поверхности макропористого монолитного минидиска комплекс хитинолитических ферментов, выделенных из культуральной среды бактерий Clostridium paraputrificum. Комплекс хитинолитических ферментов был совместно иммобилизован на полимерной матрице многоступенчатым методом, включающим введение промежуточного макромолекулярного спейсера. Проведено изучение эндохитиназной и N-ацетилглюкозаминидазной активности гетерогенного биокатализатора.

  • НОВЫЙ АНТИПРОТЕИНАЗНЫЙ ГЕМОСОРБЕНТ

    ВАЛУЕВ И.Л., ВАЛУЕВ Л.И., ВАЛУЕВА Т.А., ВАНЧУГОВА Л.В. — 2014 г.

    Разработан способ получения гидрогелевого биоспецифического гемосорбента путем радикальной сополимеризации ненасыщенного производного овомукоида из белка утиных яиц с акриламидом и N,N-метиленбисакриламидом в водном растворе в присутствии передатчика цепи – меркаптоуксусной кислоты. Показано, что использование передатчика цепи приводит к изменению структуры образующегося гидрогеля: увеличению степени его набухания в водных растворах и снижению количества пор большого размера. При этом создаются благоприятные условия для функционирования иммобилизованного овомукоида, что приводит к повышению емкости гемосорбента по отношению к сериновым протеиназам.

  • НОВЫЙ МЕТОД ИММОБИЛИЗАЦИИ АРГИНАЗЫ I С ПОМОЩЬЮ ЦЕЛЛЮЛОЗОСВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА, ПОЛУЧЕНИЕ L-ОРНИТИНА

    БАЙ Г., БАЙ Ф., ЛИ М., ЧЖАН К., ЧУ Х., ЯНГ ДЖ. — 2014 г.

    Получен рекомбинантный штамм Escherichia coli pET35b-ARG, обладающий способностью к сверхэкспрессии аргиназы I, слитой с целлюлозосвязывающим доменом (ЦСД). Аргиназа I с помощью ЦСД была иммобилизована на целлюлозных микросферах. При проведении реакции в оптимальных условиях при 40°С, рН 9.5, в присутствии 1.0 мМ Mn2+, 30 мкл/мл иммобилизованного фермента и 30 г/л L-Арг в течение 1 ч степень конверсии L-Арг составила 98.7%. После 7-кратного использования в реакции 30 мкл иммобилизованного фермента в 1.0 мл раствора было получено 153 мг L-Орн 97.3%-ной чистоты. Полученные результаты показали эффективность разработанного метода иммобилизации и перспективность его использования для получения L-Орн.

  • ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ИНУЛИНАЗ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

    АРТЮХОВ В.Г., ГРЕЧКИНА М.В., КОВАЛЁВА Т.А., ОСТАНКОВА И.В., ХОЛЯВКА М.Г. — 2014 г.

    Исследована структурная организация инулиназы дрожжевого, грибного и растительного происхождения. Для определения молекулярной массы и структуры ферментов использовали подход, заключающийся в сочетании атомно-силовой микроскопии с методами динамического светорассеяния, гель-хроматографии и электрофореза. Показано, что инулиназы из Kluyveromyces marxianus и Aspergillus niger образуют гетеродимеры, а инулиназы из клубней Helianthus tuberosus представлены как димерной, так и мономерной формами. Обсуждается вопрос о роли различных форм в проявлении функциональной активности молекул инулиназ.

  • ПЕПТИДОСОДЕРЖАЩАЯ ФРАКЦИЯ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЫ FUSARIUM SAMBUCINUM: СОСТАВ И БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ

    БЕРЕЗИН Б.Б., БОГДАНОВ В.В., ИЛЬИНА А.П., ФАТКУЛИНА Э.Ф., ЯМСКОВ И.А., ЯМСКОВА В.П. — 2014 г.

    Культуральную жидкость гриба Fusarium sambucinum исследовали на содержание в ней новой группы пептидосодержащих биорегуляторов, ранее обнаруженных в различных тканях млекопитающих и растений. Выделена фракция, содержащая пептиды с молекулярной массой от 1000 до 2000 Да, которая проявляла специфическую мембранотропную активность, а также ряд физико-химических свойств, характерных для биорегуляторов данной группы. Впервые изучено действие данной фракции на модели роллерного органотипического культивирования ткани печени тритона Pleurodeles waltl in vitro, которое выражалось в дополнительной активации пигментированных клеток печени тритона – аналогов купферовских клеток печени млекопитающих, а также в поддержании адгезионных межклеточных взаимодействий в ткани. Полученные результаты показывают, что в культуральной среде гриба F. sambucinum присутствуют пептидосодержащие биорегуляторы новой группы.

  • ПОЗДРАВЛЯЕМ АЛЕКСЕЯ МИХАЙЛОВИЧА БЕЗБОРОДОВА С ЮБИЛЕЕМ

    2014

  • ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ ЛАКТОФЕРРИНА И PН-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ МИКРОЧАСТИЦЫ НА ИХ ОСНОВЕ

    БАЛАБУШЕВИЧ Н.Г., БЕЗБОРОДОВА О.А., БОРЗЕНКОВА Н.В., ИЗУМРУДОВ В.А., ЛАРИОНОВА Н.И., НЕМЦОВА Е.Р., ЯКУБОВСКАЯ Р.И. — 2014 г.

    Приготовлены и исследованы суспензии нерастворимых полиэлектролитных комплексов декстрансульфата (ДС) различной молекулярной массы с лактоферрином (ЛФ). Изучена эффективность включения ЛФ и ДС в комплекс при рН 3.0 и 4.0, определены размеры и -потенциал частиц. Комплексы, сформированные при рН 3.0, отличались более высокой стабильностью. Взаимодействие с ДС приводило к двукратному снижению антиоксидантной активности ЛФ, хотя по данным ИК-спектроскопии комплексообразование не сопровождалось конформационными изменениями молекул ЛФ. Микрокапсулирование осуществляли обработкой суспензий отрицательно заряженных комплексов ЛФ-ДС растворами протамина или хитозана различной молекулярной массы. Определение состава, размера и -потенциала продуктов взаимодействия позволило подобрать условия приготовления рН-зависимых полиэлектролитных микрочастиц с максимальным включением ЛФ, которые способны постепенно высвобождать гликопротеин в условиях, моделирующих прохождение желудочно-кишечного тракта человека. Полученные данные свидетельствуют о перспективности разрабатываемого подхода для формирования рН-чувствительных биополиэлектролитных микрочастиц, пригодных для доставки ЛФ к клеткам-мишеням при пероральном введении.

  • ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ ПРОТЕИНАЗ EURYGASTER INTEGRICEPS PUT., ГИДРОЛИЗУЮЩИХ ГЛЮТЕНИН

    ДОЛГИХ В.В., КОНАРЕВ А.В., СЕНДЕРСКИЙ И.В. — 2014 г.

    В векторы pPIC9 и pPIC3.5 были встроены кДНК, кодирующие зрелую форму глютeнин-гидролизующей трипсиноподобной протеиназы насекомого-вредителя Eurygaster integriceps Put., обозначенной как GHP3 (glutenin hydrolyzing proteinase 3), и ее зимоген с сигнальным пептидом, ответственным за секрецию белка соответственно. Сконструированные плазмиды были использованы для экспрессии белков в клетках метилотрофных дрожжей Pichia pastoris. Рекомбинантный белок, соответствующий зрелой форме протеиназы, секретировался в культуральную среду и обладал протеолитической активностью, а зимоген приобретал активность после активирования трипсином. Оба рекомбинантных фермента гидролизовали высокомолекулярные субъединицы глютенина пшеницы сорта Ege-88 и ряда других сортов мягкой и твердой пшеницы. Показано, что ингибитор химотрипсина I из картофеля и родственные ему ингибиторы из семян растений подкласса Asteridae, ингибитор трипсина Кунитца из сои, а также апротинин быка слабо подавляли активность рекомбинантных протеиназ, в то время как ингибитор трипсина и химотрипсина Бауман-Бирк из сои не взаимодействовал с этими ферментами.

  • ПОЛУЧЕНИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТА C-41 CHLAMYDOMONAS REINHARDTII – СУПЕРПРОДУЦЕНТА ?-КАРОТИНА

    ЛАДЫГИН В.Г. — 2014 г.

    Изучен состав каротинов и ксантофиллов мутанта С-41 одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii Dang. – суперпродуцента -каротина. Установлено, что у мутанта С-41 нарушены светособирающие комплексы и комплекс реакционного центра ФС-II. При этом он сохранял достаточно высокую (до 46%) фотосинтетическую активность и способность накапливать хлорофиллы и каротиноиды (до 50%). Изучение состава каротинов показало, что в отличие от клеток дикого типа К(+), накапливающих 95% ?-каротина и 5% -каротина, в клетках мутанта С-41 содержалось 43% ?-каротина, 19% ?-зеакаротина и 38% -каротина. Высокий уровень накопления биомассы мутанта С-41 позволил рекомендовать его для использования в качестве суперпродуцента -каротина в фотобиотехнологии.

  • ПРИМЕНЕНИЕ ДИАГНОСТИКУМА НА ОСНОВЕ ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫХ УГЛЕРОДНЫХ НАНОЧАСТИЦ ДЛЯ МОНИТОРИНГА АФФИННОЙ ОЧИСТКИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

    БОЧКОВА М.С., РАЕВ М.Б., ХРАМЦОВ П.В. — 2014 г.

    Исследовано применение диагностического реагента на основе углеродных наночастиц ковалентно функционализированных G-белком стрептококка для создания системы мониторинга и оптимизации технологии аффинной очистки поликлональных кроличьих антител к альфа-фетопротеину. Разработанная система позволяет за короткое время (45 мин) провести полуколичественную оценку содержания иммуноглобулина (IgG) большинства высших животных и человека в образце сыворотки крови и элюате. Чувствительность определения IgG при помощи диагностикума углерод–G-белок составила 80 нг/мл. Разработаны подходы к стабилизации компонентов систем анализа, обеспечивающие сохранение их функциональных свойств при длительном хранении. Для диагностикума срок хранения составляет более 20 лет, для иммуносорбентов – более полутора лет. Разработана методика длительного хранения иммуносорбентов, использующихся в анализе. Применение тест-системы возможно без наличия регистрационной аппаратуры.