ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 429, № 3, с. 411-415
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.152.3
К МЕХАНИЗМУ НЕПРОДУКТИВНОГО СВЯЗЫВАНИЯ СУБСТРАТОВ ХОЛИНЭСТЕРАЗ
© 2009 г. Е. В. Розенгарт, Н. Е. Басова, А. А. Суворов
Представлено академиком В.А. Свидерским 12.04.2009 г. Поступило 12.05.2009 г.
В сравнительной энзимологии субстратная специфичность является "визитной карточкой" всех ферментов и особенно таких как холинэсте-разы (ХЭ), обладающие выраженной видовой и тканевой специфичностью, для которых изучен чрезвычайно широкий набор синтезированных субстратов [1, 2]. С учетом представлений о многофункциональной роли субстрата понятие субстратной специфичности включает самые различные аспекты реакционной способности ХЭ [3]. Здесь важнейшую роль играет природа ХЭ, структура субстратов, а также особенности строения обратимых и необратимых ингибиторов, взаимодействие с которыми также происходит в присутствии субстратов.
В настоящей работе мы решили более подробно исследовать влияние природы ХЭ и структуры субстратов на кинетические параметры феномена непродуктивного связывания субстратов в активном центре ХЭ [4—6], оказывающей существенное влияние на общий процесс ферментативного гидролиза.
В качестве источников ферментов использовали очищенные препараты ацетил-ХЭ эритроцитов человека (АХЭ, НФ 3.1.1.7) и бутирил-ХЭ сыворотки крови лошади (БХЭ, НФ 3.1.1.8) с удельной активностью соответственно 1.2 и 9.6 ед. (Пермский НИИ вакции и сывороток), а в качестве препарата ХЭ кальмара (КХЭ) был тестирован центрифугат (800§, 15 мин) водного гомогена-та (3 мг/мл) ткани зрительных ганглиев тихоокеанского кальмара, Тоёагоёе8 расШсш [1, 6].
Субстратами [7] были производные ацетилхо-лина (АХ) общей формулы СИ3С(0)0С2И4№ (Я1Я2Я3)1-: Я1 = Я2 = Я3 = Ме (АХ, I); Я1 = Я2 = Ме, Я3 = Б1 (II); Я1 = Я2 = Б1, Я3 = Ме (III); Я1 = Я2 = = Я3 = Б1 (IV); Я1 = Я2 = Ме, Я3 = Рг (V); Я1 = Я2 = = Ме, Я3 = Ви (VI); Я1 = Я2 = Ме, Я3 = Ат (VII); Я1 = = Я2 = Ме, Я3 = ьРг (VIII); Я1 = Я2 = Рг, Я3 = Ме (IX); Я1 = Я2 = Ви, Я3 = Ме (X), а также циклические производные АХ общей формулы СИ3С(0)0С2И4-Х1—:
X = —N Я
О
Я = Ме (XI); Я = Ег (XII); X
Я
Я = Ме (XIII); Я = Ег (XIV).
+
Ферментативную активность определяли методом потенциометрического титрования (рИ 7.2—7.5; 25°С) [1]. Кинетические параметры (КМ, V) определяли графическим методом [1]. Для расчета величин ас (ас = V/[E]) использовали концентрацию активных центров [Е], вычисленную на основании параметров гидролиза АХ: ас (БХЭ) = 6 ■ 104 мин-1, ас (АХЭ) = = 3 ■ 105 мин-1 [1].
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
Кинетический анализ. Представлена схема хо-линэстеразного гидролиза субстратов с учетом их непродуктивного связывания [4, 6]:
Е + Е8'
к-1 \
+ V
Е + Р2
(1)
Кв
где Е8 — продуктивный сорбционный фермент-субстратный комплекс Михаэлиса, Е8В — непродуктивный сорбционный фермент-субстратный
В
412
РОЗЕНГАРТ и др.
комплекс, Кв — константа диссоциации комплекса Е8в, характеризующая непродуктивное связывание.
Схема (1) приводит к видоизмененному уравнению Михаэлиса—Ментен:
к2къ
Кв
Де[Е ] о [ 8 ] = к2 + кз Кв + К* Км + [ 8 ]
[ Е ]о[ 8 ]
+ [ 8 ]
Кв + К*
м
д*сР [Е ] о [ 8 ] КМр+ [8] ,
(2)
где Км и ас — константа Михаэлиса и активность каталитического центра, определяемые в опыте; К* и а* — действительные величины этих параметров, согласно формулам (3) и (4)
(к + к2) кз
Км -
ас -
к1(к2 + к3 )
к2кз
к2 + кз
(3)
(4)
где р — коэффициент, выражающий долю продуктивного связывания субстратов в процессе ферментативного гидролиза
[ Е8 ] + [ Е8' ]
Кв
Кв + КМ
(5)
[ Е8 ] + [ Е8' ] + [ Е8в
Если Кв > К* , тор = 1, ас = а* , Км = К* , т.е. непродуктивное связывание практически отсутствует и каждая сорбирующаяся в активном центре молекула субстрата гидролизуется. Если Кв <§ К*, то К
р = — ^ 0, ас = а*р ^ 0, т.е. непродуктивное К*
связывание доминирует и такое соединение будет не субстратом, а обратимым ингибитором.
Исследованные субстраты будучи ацетатами должны иметь одинаковую константу деацилиро-вания (к3). Одинаковая электронная плотность на карбоксильном углеродном атоме [6] предполагает одинаковую прочность сложноэфирной связи, а следовательно, и сходные величины константы ацилирования (к2). Тем самым все исследованные субстраты не должны различаться по величинам ас (4). Вероятно при равных [Е]0 отличия в величинах максимальной скорости холинэстеразного гидролиза этих субстратов (V = ас[Е]0) будут вызваны главным образом равными значениями коэффициента р, т.е. отношение экспериментальных значений ас для АХ и любого из изученных субстратов будет равно отношению величин р
а с (АХ) = р( АХ). (6)
Величину коэффициента р для данного субстрата можно оценить лишь относительно, приняв для АХ р = 1 (Кв = да), пренебрегая тем самым его непродуктивным связыванием. Тогда
ас ( АХ)
С учетом (2) и (6)
- —,
Кв -
Р К
1 - р _ 1 -р 1
К
р -1
(7)
(8)
(9)
(10)
Для ферментативной кинетики принципиаль-
ас
ное значение имеет отношение . Во-первых, оно характеризует скорость реакции при [8] <§ К*, когда (2) принимает вид V = а с[Е ] о[8] . Во-вторых, ве-
личина этого отношения не зависит от непродуктивной сорбции, так как с учетом (2), (3) и (4)
а*р
к1 к2
К
К*р К* к-1 + к2
(11)
В-третьих, это отношение позволяет оценить величину константы скорости образования комплекса Михаэлиса к1 (11): поскольку ———
к1 + к2
< 1,
то к1 > — . В случае исследованных субстратов,
К*
*
для которых константу ацетилирования (к2) можно считать практически одинаковой, величина
отношения — дает полезную информацию о киК*
нетике продуктивного связывания. Относительное постоянство величины этого отношения будет свидетельствовать о неизменности величин к1 и к-1, ее понижение — об уменьшении к1 и увеличении к-1, а ее повышение — об увеличении к1 и снижении к-1.
Представленные в табл. 1 субстраты можно подразделить на несколько структурных групп. Так, в группе соединений I—IV происходит градуальное превращение триметиламмониевой группировки АХ (I) в триэтиламмониевую (IV). Для всех тестируемых ХЭ это сопровождалось снижением величины ас, но если для КХЭ и АХЭ это уменьшение составило 30—35%, то для БХЭ оно было 3-кратным. Вторая группа объединяет диме-тилалкиламмониевые производные (I, II, V—VIII), у которых по мере удлинения алкила (по длине
с
К МЕХАНИЗМУ НЕПРОДУКТИВНОГО СВЯЗЫВАНИЯ
413
Таблица 1. Кинетические параметры продуктивного и непродуктивного связывания при гидролизе производных ацетилхолина (АХ) с различной структурой аммониевой группировки под действием ХЭ сыворотки лошади (БХЭ), ХЭ бычьих эритроцитов (АХЭ) и ХЭ зрительных ганглиев тихоокеанского кальмара Т. расШсш (КХЭ)
Субстрат 1ё(ас) « Каг) КМ а-, % КМ Р КМ Кв
БХЭ АХЭ КХЭ БХЭ АХЭ КХЭ БХЭ АХЭ КХЭ БХЭ АХЭ КХЭ БХЭ АХЭ КХЭ
I 4.78 5.48 5.04 8.03 9.18 9.40 100 100 100 1 1 1 0 0 0
II 4.78 5.50 5.08 8.15 9.18 9.30 130 100 80 1.0 1.0 1.0 0.0 0.0 0.0
III 4.65 5.42 4.95 8.00 9.18 9.35 95 100 90 0.75 0.87 0.82 0.33 0.15 0.22
IV 4.32 5.28 4.90 7.85 8.84 9.43 65 45 110 0.35 0.64 0.73 1.8 0.58 0.38
V 4.28 5.34 4.93 7.70 9.08 9.45 50 80 115 0.32 0.73 0.78 2.1 0.38 0.28
VI 4.34 5.20 4.90 8.00 8.60 9.50 90 25 130 0.37 0.54 0.74 1.7 0.86 0.35
VII 4.68 5.20 4.85 8.13 9.04 9.30 120 75 80 0.80 0.54 0.63 0.25 0.86 0.60
VIII 4.28 5.40 4.95 7.70 9.20 9.30 50 105 80 0.82 0.85 0.82 2.1 0.18 0.22
IX 3.48 4.51 4.48 6.30 7.60 8.30 2 3 10 0.05 0.11 0.27 19 8.1 2.7
X - - 4.00 - - 7.15 - - 1 - - 0.01 - - 99
XI 4.12 5.40 4.94 7.90 9.00 9.45 75 65 115 0.22 0.83 0.79 3.5 0.20 0.27
XII 4.51 5.40 4.95 8.11 9.15 9.50 105 95 120 0.53 0.83 0.82 0.90 0.20 0.22
XIII 3.48 5.28 4.87 7.90 8.60 9.48 75 25 120 0.05 0.64 0.67 19 0.57 0.50
XIV 4.18 5.20 4.87 7.95 8.48 9.48 85 20 120 0.25 0.54 0.67 3.0 0.86 0.50
Примечание. КМ — действительная величина константы Михаэлиса (3), (8); Кв — константа диссоциации непродуктивного
фермент-субстратного комплекса (9); отношение — (10).
КВ
нормальной алкильной цепи изопропил (VIII) следует поместить перед пропилом (V)) способность к гидролизу снижалась по-разному. В случае КХЭ и АХЭ величина ас уменьшалась монотонно на 35—45%, а в случае БХЭ резкое снижение (в 3 раза) отмечалось для пропильного (V) и изопропильного (VIII) производных, а затем скорость гидролиза возрастала и амильный аналог (VII) гидролизовался лишь на 20% медленнее, чем АХ. Третья группа — это диалкилметиламмо-ниевые производные (I, III, IX, X). И здесь снижение способности к ферментативному гидролизу зависело от природы ХЭ: так, в случае соединения IX для БХЭ это уменьшение было наиболее выраженным (в 20 раз), для АХЭ — в 9 раз, а для КХЭ — в 3.5 раза. Дибутилметиламмониевое производное (X) вообще не гидролизовалось под действием БХЭ и АХЭ и оказалось обратимым ингибитором этих ХЭ смешанного типа действия (величина ингибиторной константы К равна 1 • 10-3 и 1 • 10-4 М соответственно). А в случае КХЭ соединение X оказалось плохим, но все-таки субстратом [1, 2]. Четвертая группа включает циклические пирролидиниевые (XI и XII) и пипериди-ниевые производные (XIII и XIV). Метилаты (XI и XIII) гидролизовались медленнее, чем этилаты
(XII и XIV), только под действием БХЭ, а иодмети-лат М-ацетоксиэтиленпиперидиния (XIII) оказался новым специфическим субстратом АХЭ (величина ас была в 65 раз выше, чем для БХЭ) [1, 2].
Для ферментативной кинетики принципиаль-
ас
ное значение имеет отношение —-- , которое не
КМ
зависит от непродуктивной сорбции и позволяет оценить скорость образования комплекса Михаэлиса (см. выше (11)). В случае исследованных субстратов, для которых константу ацетилирова-ния (к2) можно считать практически одинаковой,
величина отношения — дает информацию о ки-
КМ
нетике продуктивного связывания. Относительное постоянство величины этого отношения свидетельствует о неизменности величин к1 и к_1, ее понижение — об уменьшении к1 и увеличении к_1, а ее повышение — об увеличении к1 и снижении к_ 1. В целом для исследованных субстратов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.