ЗООЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2015, том 94, № 8, с. 972-984
МЕТОДЫ ^^^^^^
ЗООЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
УДК 592:591.543.1
К МЕТОДАМ ИССЛЕДОВАНИЯ ХОЛОДОУСТОЙЧИВОСТИ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ
© 2015 г. А. Н. Лейрих, Е. Н. Мещерякова
Институт биологических проблем Севера ДВО РАН, Магадан 685000, Россия
e-mail: aborigen@ibpn.ru Поступила в редакцию 26.08.2014 г.
Различия в методах сбора и лабораторного содержания животных до опытов, режимов акклимации, использование разной измерительной аппаратуры существенно влияют на результаты эксперимента и затрудняют сравнение получаемых данных. Обсуждаются факторы, учет которых необходим при изучении холодоустойчивости беспозвоночных животных. Описаны методы измерения температуры максимального переохлаждения и порогов длительно переносимых низких температур, обоснованы скорости охлаждения объектов. Предварительное изучение факторов среды и адаптация методических приемов к особенностям используемой беспозвоночным животным стратегии холодоустойчивости способствуют исключению артефактов.
Ключевые слова: беспозвоночные животные, холодоустойчивость, методические приемы, акклима-ция, температура максимального переохлаждения, пороги длительно переносимых температур
DOI: 10.7868/S0044513415080103
Исследования холодоустойчивости беспозвоночных животных и физико-химических, биохимических и генетических механизмов ее обеспечения активно развиваются в течение полувека в нескольких лабораториях за рубежом и в России. Общее представление о современном состоянии проблемы дает монография "Low temperature biology of insects" (2010), однако методические подходы отражены в ней недостаточно полно. Наблюдаемая экспериментатором холодоустойчивость служит интегральной характеристикой, формирующейся под воздействием на организм животного многих факторов внешней среды. Различия в методах сбора и лабораторного содержания животных до опытов, режимов акклимации, использование разной измерительной аппаратуры — все это существенно влияет на результаты эксперимента и затрудняет сравнение получаемых данных. Порой невозможно оценить, объясняется ли несоответствие в холодоустойчивости вида, полученное разными исследователями, особенностями животных конкретной популяции или оно связано с различиями примененных в экспериментах методических приемов. Ярким примером служит холодоустойчивость коконов дождевого червя Dendrodrilus rubidus tenuis (Eisen 1874), которая, по нашим данным в охотомор-ской популяции достигает —196°С (Берман и др., 2010), в то время как в скандинавской популяции - лишь —8°С (Holmstrup, 1994).
В лаборатории биоценологии Института биологических проблем Севера ДВО РАН (г. Магадан) исследования холодоустойчивости беспозвоночных животных, обитающих в экстремально холодных регионах, проводятся почти 35 лет. Изучена холодоустойчивость зимующих в почве или подстилке муравьев, жуков-щелкунов, прямокрылых, наземных брюхоногих моллюсков и бокоплавов, многоножек, сенокосцев, дождевых червей. Накоплен опыт экспериментальной работы, который помогает в значительной мере исключить артефакты. Большая часть исследований проведена на животных, обитающих на Северо-востоке Азии в континентальной и прибрежной частях Магаданской обл. Климат региона характеризуется длительной и холодной зимой. В верховьях Колымы при среднемесячной температуре воздуха в январе —34°С и среднем из абсолютных минимумов —51°С (метеостанция Усть-Омчуг) в силу различного сочетания факторов, формирующих зимний термический режим почвенных горизонтов, диапазон минимальных температур в верхнем 20 сантиметровом слое почвы составляет от —10 до —40°С. Зимующие здесь животные подвержены длительному воздействию низких температур, что дает основания ожидать у них максимального проявления холодовых адаптаций.
В настоящей статье обсуждаются факторы, учет которых необходим для получения адекватной оценки устойчивости к отрицательным тем-
пературам зимующих беспозвоночных. Это, прежде всего, условия и длительность хранения животных до экспериментов, режимы акклима-ции и скорости охлаждения.
Способы перенесения беспозвоночными отрицательных температур
По типу реакции на охлаждение беспозвоночных подразделяют на несколько категорий. Гибель чувствительных к охлаждению организмов (chilling intolerant в англоязычной литературе) происходит в диапазоне температур от 10—15°С до нескольких градусов ниже нуля и не связана с образованием льда в теле (Low temperature..., 2010). Виды, обитающие на территориях с выраженным сезонным ходом температуры воздуха (а следовательно, и почвы, стволов деревьев и прочих мест зимовки), как правило, адаптированы к воздействию отрицательных температур. Зимующие беспозвоночные используют три основные стратегии холодоустойчивости. Не переносящие замерзания виды (freezing intolerant, freezing susceptible), как правило, способны значительно переохлаждаться. Устойчивые к замерзанию (freezing tolerant), напротив, выдерживают образование льда в теле, обычно внеклеточное. Защитная дегидратация (protective dehydration), впервые выявленная у коконов дождевых червей (Holmstrup, Westh, 1994), выделена в последние годы в качестве отдельной стратегии холодоустойчивости (Holmstrup, Zachariassen, 1996; Worland et al., 1998; Wharton et al., 2003; Лейрих и др., 2005; Берман и др., 2010; 2011).
Не переносящие замерзание животные выдерживают значительное охлаждение, оставаясь в физическом смысле незамерзшими (т.е. без образования льда в организме). Это достигается как снижением температуры замерзания жидкостей тела в результате накопления антифризов, так и увеличением способности к переохлаждению. Устойчивость к низким температурам у зимующих в состоянии защитной дегидратации организмов сопряжена с потерей почти всей осмотически активной воды, что также ведет к увеличению концентрации жидкостей тела и снижению температуры замерзания (Holmstrup, Zachariassen, 1996) при сохранении незначительной способности к переохлаждению. При крайней выраженности этого механизма у дегидратированных коконов дождевых червей не удается зарегистрировать сопровождающий кристаллизацию жидкости подъем температуры (Лейрих и др., 2005), т.к. в них не остается осмотически активной способной замерзать воды. Образование льда в теле гибельно для представителей обеих этих групп. Устойчивые к замерзанию организмы, напротив, восстанавливают все жизненные функции после оттаивания. Холодоустойчивость у большинства
беспозвоночных подвержена сезонной изменчивости.
Критерии холодоустойчивости
Среди изученных нами групп животных выявлены носители всех трех ныне известных механизмов холодоустойчивости. Методические подходы при работе с ними различаются.
Для зимующих в переохлажденном состоянии организмов температура максимального переохлаждения (точка переохлаждения, Тп) является наиболее низкой, которую они еще могут кратковременно перенести. Однако в большом числе случаев смертность беспозвоночных при постоянных низких температурах зависит от времени (см. ниже). Поэтому даже для зимующих в переохлажденном состоянии видов желательно определять помимо Тп также и устойчивость к длительному воздействию холода, характеризующуюся температурой, при которой погибает половина особей при суточной экспозиции (ЛТ50%) (Ring, 1982). Если количество материала достаточно для проведения экспериментов, предпочтительно выяснять пороги смертности при разных температурах. Это позволит выявить как безопасный для зимовки диапазон, так и температуру, вызывающую гибель всей выборки.
Для зимующих в замерзшем состоянии организмов Тп не имеет экологического смысла и лишь указывает на вероятный способ обеспечения холодоустойчивости. В этом случае, как и для животных, использующих механизм защитной дегидратации, холодоустойчивость можно охарактеризовать, лишь выяснив пороги смертности при длительной экспозиции.
Условия хранения и акклимации беспозвоночных
Сбор и хранение. Единовременный сбор значительных серий зимующих в природе животных большинства групп невозможен, поэтому особое значение для сохранения естественных характеристик холодоустойчивости, заметим, весьма лабильных, имеют режим акклимации, длительность и условия содержания (хранения) животных перед экспериментами. Исключение составляют муравьи, гнезда которых можно маркировать осенью и раскопать зимой. Эта трудоемкая работа также требует предосторожностей: насекомые при раскопках не должны подвергаться охлаждению ниже наблюдающихся в зимовочных камерах температур.
Поэтому все остальные многочисленные объекты исследований собирали поздней осенью, перед замораживанием почвы, чтобы значительная часть предзимней подготовки была пройдена ими в природе. Затем животных разделяли на серии, помещали в подходящий субстрат и продол-
жали акклимацию в условиях, насколько возможно, приближенных к естественным.
Напомним, что акклимация — приспособление организма к искусственно созданным условиям (Биологический., 1986), в нашем случае — имитирующим осеннее-зимний ход температуры в природе. Акклиматизация — адаптация, происходящая под воздействием меняющихся условий естественной среды.
Существенная особенность осеннего хода температур почв и грунтов в регионах с континентальным климатом и вечной мерзлотой — нулевая изотермия. Из-за выделения тепла при замерзании влаги в почве и грунтах между промерзшим поверхностным горизонтом и "зеркалом" мерзлоты устанавливается температура около 0°С. Продолжительность периода с нулевой изотер-мией, в зависимости от влажности почвы, температуры воздуха, наличия и высоты снежного покрова может варьировать в очень широких пределах. По нашим данным, в верховьях Колымы в разные годы околонулевые температуры сохранялись в обитаемом беспозвоночными слое на протяжении 2—6 недель (Берман и др., 2007). В регионах, где наблюдается только сезонное промерзание, температурный режим обитаемого слоя почвы может существенно различаться не только минимальными значениями температуры, но и характером переходного (через 0°С) периода. Длительность такого переходного периода неодинаково сказывается на холодоустойчивости разных групп орга
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.